基于网络药理学探讨热毒宁注射液治疗登革热的分子机制

吴鹏，江勇，郑文江，赖艳妮，黄秀芳，庄轰发，詹少锋，刘小虹

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州510405；2.深圳市中西医结合医院，广东深圳518104；3.广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405）

登革热（Dengue fever）是感染登革病毒（Dengue virus）引起的一种急性传染病，广泛流行于全球热带及亚热带地区，主要通过蚊媒传播。据世界卫生组织（WHO）[1-2]统计，登革热在过去的50年间发病率增加了30倍，全球约有25亿人口面临登革热感染风险，各成员国报告的病例数高达320万人。随着全球变暖，其流行范围有向温带和寒带扩散的趋势，日益频繁的国际交流和经贸合作也为输入性疫情防控带来了严峻挑战。

登革病毒可分为4种血清型，各血清型之间、登革病毒与其他黄病毒属病毒之间具有交叉反应。其发病机制尚不明确，但多认为与抗体依赖的增强感染作用（ADE）、细胞因子风暴、宿主遗传多态性、病毒分子、先前感染病史等因素有关[3-4]，给抗病毒治疗药物和疫苗的研发带来了极大的挑战。由于缺乏有效的抗病毒治疗药物，目前临床上治疗登革热以对症支持为主[5]。首个获批上市的疫苗存在增加罹患重症登革热的风险，仅推荐用于流行地区既往感染的人群使用，无法满足防治需要[2]。因此，开发天然的中草药可为相关研究提供新的思考方向。

热毒宁注射液是由青蒿、金银花、栀子组成的中药注射液制剂，具有清热、疏风、解毒作用，临床上被广泛应用于感染性急症的治疗。作为国家二类新药，已被多部国家卫生部发布的诊疗指南收录，用于登革热、甲型H1N1流感、人感染H7N9禽流感、足口病和新型冠状病毒肺炎等病毒性传染病的救治[6-7]。证据显示，热毒宁注射液治疗普通型登革热，不仅在缩短发热时间、改善白细胞和血小板水平、提高痊愈率方面具有显著优势，而且安全性良好[8]。鉴于中药多成分、多靶点、多途径的作用特点及网络药理学的系统整合研究方法[9]，本研究试从网络药理学角度分析热毒宁注射液治疗登革热的分子机制，以期为进一步研究提供科学依据，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 药效成分及作用靶点的收集首先收集公开报道的热毒宁注射液药效成分[10-11]，然后将化合物名称输入PubChem数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下载其2D结构SDF文件，并将文件逐一上传至SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstarget-prediction.ch/），限定物种为人，以CSV文件格式下载数据库预测的各个药效成分靶标基因，剔除Probability为0的靶点后，将所有成分-靶点整合至一张Microsoft Excel表格备用。

1.2 登革热相关靶点收集以“dengue”为检索词在CTD（http://ctdbase.org/）、OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）中获取登革热相关基因，将所有基因整合至Excel表格，删重备用。

1.3 关键靶点蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建将“1.1”和“1.2”项获得的药物靶点和疾病靶点分别上传至Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘 制 韦 恩图，并获取交集靶点基因列表。将交集靶点列表上 传 至STRING数 据 库（https://string-db.org/，Version 10.5）。限定物种为人，获取靶蛋白之间的作用关系，并将结果保存为TSV文件格式，将文件导入Cytoscape 3.7.1可视化得到初始PPI网络。用其工具Network Analyzer对该网络进行拓扑分析，根据节点度（Degree）值的2倍中位数筛选出关键靶点，隐藏其余靶点，并可视化展示。

1.4 药效成分-交集靶点网络构建及关键药效成分筛选将“1.1”和“1.3”项获得的药效成分靶点与交集靶点相互映射，通过Cytoscape 3.7.1构建药物活性成分-交集靶点网络。利用网络的筛选功能，在交集靶点中展示“1.3”项获得的关键靶点，并反向筛选出关键靶点对应的药效成分，作为关键药效成分。

1.5 基因本体论（GO）富集分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析将交集靶点上传 至Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）。限定物种为人，选择“自定义分析（custom analysis）”，分别进行GO富集分析和KEGG通路分析。其中，GO富集分析包括生物过程（biological process）、分 子 功 能（molecular function）和细胞组分（cellular component）3个模块；KEGG通路分析设定P＜0.01，以确定交集靶点富集通路，进一步去除其他疾病信号通路，筛选出关键靶点富集较多的通路作为关键通路。

2 结果

2.1 热毒宁注射液药效成分本研究通过对文献的收集整理，得到热毒宁注射液化学成分72个，最终在PubChem数据库检索到32个成分，结果见表1。

表1 热毒宁注射液药效成分信息Table 1 Information on pharmacodynamic constituents of Reduning Injection

2.2 药物靶点和疾病靶点收集经SwissTargetPrediction数据库预测，32个化合物共获得1 350个靶点，删重后得到410个。以“dengue”为检索词，分别在CTD得 到2 675个、GeneCards 735个、OMIM 24个、TTD 3个靶点基因，删重后得到3 219个靶点。

2.3 关键靶点PPI网络构建将上述药物靶点与疾病靶点上传至Draw Venn Diagram获得两者交集的靶点154个，见图1-A。将154个交集靶点上传至STRING平台，获得PPI网络TSV文件，再导入Cytoscape 3.7.1软件得到初始PPI网络，经Network Analyzer拓扑分析后将结果导出至Excel 2016，按照度值降序排列154个靶点，计算得到所有节点的度值的2倍中位数为44，由此筛选出度值≥44的关键靶点29个。返回Cytoscape中的初始网络，利用其筛选和隐藏功能，构建出关键靶点PPI网络，见图1-B。

2.4 药效成分-交集靶点网络构建及关键药效成分筛选将热毒宁注射液的31个成分[苯甲酸（Mol27）无交集靶点，弃去]与154个交集靶点导入Cytoscape进行网络构建和可视化，并筛选出关键靶点对应最多的成分为关键成分，见图1-C。如图所示，热毒宁注射液活性成分与交集靶点网络图共包含185个节点，503条边。菱形节点代表热毒宁注射液活性成分，圆形节点代表交集靶点，黄色节点代表筛选出的关键靶点及关键药效成分，节点越大表示该节点的度值越大，在网络中可能发挥枢纽作用。31个成分中有27个与关键靶点相作用，选取与关键靶点作用最多的8个成分进行展示，分别为异落叶松脂素（Mol9）、木犀草素（Mol16）、反式咖啡酸（Mol24）、5’-甲氧基异落叶松树脂醇（Mol7）、落叶脂素（Mol8）、异鼠李素（Mol12）、槲皮素（Mol13）和反式阿魏酸（Mol25），各作用于10、10、8、7、7、7、7、7个关键靶点，可能是热毒宁注射液发挥治疗作用的重要物质基础。

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析GO富集分析得到条目1 501个（P＜0.05），其中生物过程条目1 388个，细胞成分条目30个，分子功能条目83个。选取排名前20位的GO条目绘制柱状图，见图1-D~F。

GO富集分析结果显示：生物过程分析中富集靶点较多的有转移酶活性的正调控、对氧化应激的反应、对细菌来源分子的反应、活性氧代谢过程、细胞因子产生的正调控、细胞对氮化合物的反应、对创伤的反应和肽酰丝氨酸修饰等；细胞组分分析中富集靶点较多的有膜筏、胞质囊腔、膜侧、局灶性黏附、突触后、胞质核周区、细胞外基质和线粒体外膜等；分子功能分析中富集靶点较多的有以醇基为受体的磷酸转移酶活性、激酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质结构域特异性结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、血红素结合、丝氨酸水解酶活性和热休克蛋白结合等。

KEGG富集分析得到条目142个（P＜0.01），排名前20位的通路有甲型流感、HIF-1信号通路、EB病毒感染、癌症中的微小RNA、NF-κB信号通路、小细胞肺癌、军团菌病、白细胞跨内皮迁移、类固醇激素的生物合成、阿尔茨海默氏病、卵母细胞减数分裂、多巴胺能突触、癌症中的转录失调、碳水化合物的消化吸收、黏附连接、肌萎缩性侧索硬化症、内质网中的蛋白质加工、抗叶酸抵抗、线粒体自噬-动物、补体和凝血级联，见图1-G。将这些通路及其包含的基因导入Cytoscape进行网络构建和可视化，不考虑其他疾病信号通路，结合文献检索及通路中包含的关键靶点数量，筛选出前5条关键通路，即HIF-1信号通路、NF-κB信号通路、白细胞跨内皮迁移、黏附连接和线粒自噬，分别包含11、5、5、4、4个关键靶点，见图1-H。如图所示，通路-靶点网络共包含116个节点，226条边。圆形节点代表靶点，六边形节点代表通路，黄色圆形节点代表关键靶点，黄色六边形节点代表关键通路。

图1 热毒宁注射液治疗登革热的网络药理学分子机制Figure 1 Network pharmacologcial molecular mechanism of Reduning Injection in the treatment of dengue fever

3 讨论

登革热作为一种新兴病毒性传染病对人类健康构成了重大的威胁。尽管多数情况下感染登革病毒引起的临床症状较轻，但部分患者可出现严重出血、休克或脏器损伤等危重表型，致死率高。迄今尚无有效的策略用于预防和治疗登革病毒感染。中医药治疗登革热安全有效，因此受到研究人员的广泛关注。热毒宁注射液由金银花、青蒿、栀子3味中药组成，具有疏风、清热、解毒的作用，被卫生部推荐用于登革热的治疗。基于中药多成分、多靶点、多途径调控疾病的特点，本研究利用系统药理学及网络可视化方法探讨热毒宁注射液治疗登革热的作用机制，首先对热毒宁注射液治疗登革热的154个潜在靶点进行PPI网络分析，然后依据网络拓扑分析节点度值筛选出前29个关键靶点，再通过关键靶点反向筛选出关键成分、关键通路，以期为其基础研究和临床应用提供参考。

本研究筛选的29个关键靶点包括GAPDH、AKT1、TNF、MAPK3、CASP3、MAPK1等，涉及能量代谢、细胞凋亡、炎症反应等生物过程。GAPDH主要参与细胞糖酵解途径，近年来研究发现GAPDH还能参与许多亚细胞水平活动，包括催化微管聚合、参与蛋白磷酸化修饰、参与膜融合和膜转运、促进细胞凋亡、调节蛋白质的表达、参与DNA损伤修复、作为转铁蛋白受体等[12]。有研究[13-14]发现，登革病毒通过调节GAPDH活性，增加糖酵解通量、影响病毒转录过程及宿主细胞脂质稳态，从而促进感染和增殖。AKT1是AKT激酶的主要亚型之一，调节代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等多个生物过程。PI3K/AKT信号通路参与感染早期细胞的存活及促进登革病毒侵入，而且有助于病毒蛋白翻译[15]。运用该通路的抑制剂，可以抑制登革病毒复制[16]。TNF是细胞凋亡直接相关的促炎细胞因子。在登革热急性期，重症患者均可见显著升高的TNF-α[17-18]。TNF-α在登革热感染中具有双重作用。一方面，高表达TNF-α等位基因与登革出血热/登革休克综合征（DHF/DSS）的保护之间存在关联，可能与高水平的TNF-α在感染早期抑制登革病毒负荷相关。但另一方面：①有证据显示TNF-α并不能抑制病毒复制[19]；②TNF-α可上调树突状细胞抗细胞凋亡因子，从而延长感染的树突状细胞存活时间，可能对感染重症化有促进作用[20]；③大量的TNF-α可使血管内皮细胞活化表达免疫黏附因子，直接损伤内皮细胞，诱导血浆渗漏[21]。在重症登革热小鼠模型，运用舒尼替尼联合抗肿瘤坏死因子抗体治疗具有抗血管生成和抗炎的双重协同作用[22]，提示抗TNF可能是潜在的治疗方式。MAPK参与调节基因表达、分化、增殖、有丝分裂、凋亡和细胞存活等多个过程[23]。肝脏是登革病毒复制和发病机制密切相关的器官，登革病毒感染诱导的MAPK家族磷酸化与血管内皮功能障碍、肝功能损伤、肝细胞凋亡等有关[24]。p38 MAPK、JNK和ERK1/2抑制剂均可调节细胞凋亡的内在和外在途径，减轻登革病毒感染诱导的肝损伤[25-27]。Caspase家族是细胞凋亡事件中的核心因子，主要分为凋亡启动因子、执行因子和炎症介导因子三大类[28]，凋亡启动因子被激活以后，通过各自介导Caspase酶级联反应依次激活凋亡执行因子，最终导致细胞凋亡，其中Caspase-3的活化是细胞凋亡的中心环节[29]。

依据29个关键靶点筛选出8个关键药效成分，包括异落叶松脂素、木犀草素、反式咖啡酸、5’-甲氧基异落叶松树脂醇、落叶脂素、异鼠李素、槲皮素和反式阿魏酸。木犀草素通过减少活性氧和活性氮的生成，调节花生四烯酸的代谢和NF-κB、MAPK、AP-1、JAK、STAT等信号通路多途径发挥抗炎效应[30]。研究显示，木犀草素在体外能抑制ADE介导的登革病毒感染，在体内对4种血清型的登革病毒复制均有抑制作用[31]。异鼠李素具有心脑血管-神经保护、抗炎、抗缺氧、抗氧化、肾脏保护、肺脏保护、抗菌、抗病毒、调节免疫等作用。异鼠李素通过抑制NF-κB通路调节炎症介质、细胞因子和ROS的产生，从而发挥抗炎作用；通过激活PI3K/AKT和Nrf2/ARE信号通路抑制细胞凋亡，发挥抗氧化特性；此外，异鼠李素还具有保护血管内皮细胞的效应，可能与其抗炎、抗氧化和抗线粒体依赖性凋亡的作用有关[32]。槲皮素是已被证实的体外抗登革病毒最有效的化合物之一[33-34]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、抗病毒、抗原虫、抗菌和保护心血管等药理作用[35]。研究人员[36-37]运用分子对接等方法发现，槲皮素可能是抑制病毒E蛋白的新型有效候选物之一，并且其衍生物槲皮素3-（6’’-（E）-p-香豆酰基槐糖苷）-7-鼠李糖苷是一种有效的病毒RNA聚合酶抑制剂。由此可见，热毒宁注射液的活性成分具有抗病毒、保护血管内皮、抗炎、抗氧化等作用，对于登革热/重症登革热导致的细胞因子风暴、血浆渗漏等病理环节具有潜在的治疗价值。

由KEGG富集分析结果可知，热毒宁注射液具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗炎、调节免疫和神经保护等作用。其中与登革热最相关的通路有HIF-1信号通路、NF-κB信号通路、白细胞跨内皮迁移、黏附连接和线粒自噬，分别包含11、5、5、4、4个关键靶点。

HIF-1是机体在分子水平上应答缺氧应激的关键代谢调节因子。HIF诱导的蛋白表达主要帮助缺氧细胞的代谢和生存需要，功能包括血管再生、红细胞生成、凋亡、细胞分化/生存、糖代谢、pH值调节和铁代谢等。研究证实，登革病毒诱导的缺氧反应及代谢改变可以增强病毒RNA复制，其机制与HIF-1α/2α和AKT表达增强，厌氧糖酵解的增加有关[38]。NF-κB是参与炎症介质调节的关键转录因子。在登革病毒感染过程中，NF-κB的激活导致细胞凋亡和过度炎症反应[39]，导致登革出血热[40]，其调节的促炎细胞因子TNF-α的水平升高与重症登革热有关[41]。因此，开发相关抑制剂下调登革病毒感染诱导的炎症反应，有望成为新的治疗措施[42]。线粒体自噬对于清除损伤线粒体，维持细胞线粒体网络功能具有重要意义。近年来，病毒感染与线粒体自噬的研究开始受到关注[43]。病毒介导的线粒体自噬有助于防止细胞凋亡，从而促进病毒感染及传播；另外，线粒体自噬的抗炎效应也可以帮助病毒逃脱宿主的抗病毒免疫防御。线粒体作为协调先天免疫、自噬和炎症相关信号网络的中心枢纽，靶向线粒体的疗法为登革热的治疗提供了新视角[44]。白细胞跨内皮迁移是指白细胞跨血管内皮从血液向组织迁移，对于免疫监视和炎症至关重要。该过程有利于控制早期感染事件[45]。黏附连接对于维持组织结构和细胞极性非常重要，是控制内皮通透性最重要的组成部分之一[46]。在登革病毒感染的人内皮细胞模型中可以观察到黏附连接成分血管内皮-钙黏蛋白分解，运用特定的抑制剂可以防止分解，并消除登革病毒诱导的跨内皮渗漏[47]。

另外，类固醇激素的生物合成、内质网中的蛋白质加工、补体和凝血级联通路虽无关键靶点富集或富集较少，但与登革热的发病密切相关。类固醇激素的生物合成属于脂质代谢通路。研究发现，皮质醇在登革病毒感染早期显著升高，通过抑制细胞因子和其他促炎介质的产生下调炎症和免疫反应，有利于病程自限[48]。补体级联反应的激活可触发多种抗病毒、免疫调节作用[49]，而且补体替代途径过度活化与重症登革热有关[50]。登革热进展伴随的凝血和纤溶紊乱可能导致疾病晚期的弥散性血管内凝血[51]。研究表明，补体和凝血级联存在多处交汇，共同参与调节免疫和心血管系统功能[52]。鉴于二者级联的放大效应与疾病进展密切相关，该通路有待进一步研究，为重症登革热的诊疗提供新线索。机体缺血、缺氧、缺乏营养、氧化应激、病毒感染时，内质网内未成熟蛋白和错误折叠的蛋白大量滞留，引起内质网应激（ERS）[53]。登革病毒诱导的ERS为体内外自噬激活、病毒复制所必需[54]，并且在病毒生命周期中，登革病毒的复制和翻译很大程度上局限于ER。因此，调控登革病毒-内质网相互作用的分子可能是有效的干预策略[55]。

综上所述，热毒宁注射液治疗登革热可能通过异落叶松脂素、木犀草素、反式咖啡酸、5’-甲氧基异落叶松树脂醇、落叶脂素、异鼠李素、槲皮素和反式阿魏酸等关键成分作用于GAPDH、AKT1、TNF、MAPK、CASP3等关键靶点，调节HIF-1信号通路、NF-κB信号通路、白细胞跨内皮迁移、黏附连接和线粒自噬等关键信号通路，发挥抗病毒、抗炎、调节免疫、调节凝血和纤溶、调节能量代谢、调节脂质代谢等作用。鉴于网络药理学的局限性，本研究结果有待于进一步实验验证。