蛇床子素在体外对人肝癌细胞增殖和侵袭的抑制作用

鲍小栋，方杰，金俊华，郑桂茹

1.金华市人民医院 药学部，浙江 金华 321000；2.杭州医学院 实验动物中心，浙江 杭州 310063

以肝细胞癌为主的原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，在所有肿瘤疾病患者中约占5.6%[1-4]。在世界范围内，肝癌的发病率位居第5位，其病死率更是位列第3位；每年全球新增肝癌患者约为62.6万人，其中发展中国家的肝癌发病率要高于发达国家[4-5]。临床研究发现肝癌发生时肝脏已经受到严重损伤，且肝癌细胞具有高转移能力和高复发率的特点，使得肝癌的治疗一直是临床上面临的重要难题。中医药是我国的传统医学，在肝癌的预防和治疗方面发挥着重要的作用。蛇床子素为香豆素类代表化合物，化学名为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，来源于传统中药蛇床子[6-9]。现代药理学研究发现，蛇床子素对心脑血管系统、中枢神经系统、内分泌系统、免疫系统等方面的疾病均具有治疗效果[10]。近年来，随着对蛇床子素研究的深入，多项体外研究实验表明，蛇床子素对肿瘤细胞显示出一定的抗增殖作用[11-14]。蛇床子素作为一种低毒、具有抗肿瘤效应的天然产物提取物和先导化合物，其广泛的抗肿瘤作用虽然已被证实，但其抗肝癌细胞的增殖和侵袭的作用效果及抗肝癌相关机制仍不清楚，尚需进一步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721和Bel-7402均购于中国科学院细胞库，于液氮中保存，使用前复苏。细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的条件，待细胞贴壁生长2～3 d后采用胰蛋白酶消化传代，待细胞稳定传代2～3代后开始实验。

1.1.2 主要试剂：蛇床子素（纯度＞99%，CAS号：484-12-8）和二甲基亚砜（DMSO，纯度＞99.9%，CAS号：67-68-5）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，蛇床子素完全溶于DMSO中配制成终浓度为 10 mmol/L备用。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）（CAS号：77180-80-4，购自上海蓝木化工有限公司，10 mmol/L溶解于1 mL DMSO中）。DMEM完全培养基购自杭州乔阳生物科技有限公司，含0.25% EDTA胰酶、青链霉素购自武汉普诺赛生物科技有限公司，胎牛血清购自湖州天杭生物科技股份有限公司，钙黏蛋白E（E-cadherin）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、微管蛋白（tublin）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗均购自杭州昕诚生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT实验：用胰蛋白酶消化细胞并计数，以每孔1×104个的密度接种于96孔板中孵育24 h，待细胞完全贴壁。加入配制好的蛇床子素药液使终给药浓度分别为50、100、150、200 μmol/L。在对照组中，相同培养条件下不加蛇床子素。设置6个复 孔。培养48 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，吸去上清液，添加DMSO 150 μL，微量振荡器振荡2 min至完全溶解。在570 nm波长处检测吸光度值（OD值），并计算各实验组细胞存活。细胞存活率=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.2.2 集落形成实验：细胞计数后接种于6孔板中，每孔含细胞1×103个。在培养基中加入蛇床子素药液和阳性对照药5-FU，设置3个复孔。孵育4 d后倒置显微镜下以直径大于0.5 mm观察集落数。

1.2.3 细胞划痕实验：设置蛇床子素给药组、空白组，将细胞接种到6孔板中，待生长至80%汇合度时，除去培养基，用20 μL移液枪头末端刮擦产生划痕，加入培养基，给药组同时给予蛇床子素药液，空白组加入等量DMSO溶液，分别孵育48 h和72 h后，在电子显微镜下观察细胞迁移情况，使用计算机辅助电子测量并量化6个随机视野中每个视野中迁移到划痕区域的细胞。

1.2.4 Transwell小室实验：使用24孔Transwell板，在Transwell上室中涂0.25 mg/mL Matrigel胶。用不同浓度的蛇床子素药液（50、100 μmol/L） 与等量的DMSO处理SMMC-7721细胞24 h，予胰蛋白酶消化并接种到100 μL无血清培养基中的上部Transwell小室中，每个2×104个细胞。在下室中加入600 μL含10% FBS的完全培养基中，使细胞在含5% CO2的潮湿培养箱中在37 ℃下通过过滤器迁移48 h，将附着于膜下表面的细胞在室温下用4%多聚甲醛固定30 min，并予结晶紫染色，用棉签擦拭除去过滤器表面的细胞，在200倍下随机选取6个视野计数过滤器表面上的染色细胞数及拍照。

1.2.5 蛋白质印迹（Western blot）实验：将人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721经不同浓度的蛇床子素药液（50、100、150 μmol/L）处理48 h后，用蛋白胰酶消化并离心以沉淀细胞，加入裂解缓冲液，然后用超声波粉碎仪在冰上裂解细胞。在4 ℃，转速12 000 r/min下离心20 min。取上清液，测定蛋白质浓度，并保存在-80 ℃冰箱中。将样品蛋白质加入等体积缓冲液，混合并煮沸5 min以使蛋白质变性并通过凝胶电泳将其分离。转膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人tubulin-3、MMP-2和E-cadherin抗体（1:1 000） 4 ℃下过夜。采用羊抗兔二抗（1:2 000）室温孵育1 h，洗膜3次，用凝胶成像仪扫描成像，使用ImageJ软件分析条带，以目的蛋白平均光密度/tubulin-3平均光密度反映目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理方法 采用GraphPad Pro统计软件进行统计分析。计量数据以±s表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。所有实验均重复不少于3次。

2 结果

2.1 蛇床子素对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402细胞活力的影响 MTT实验结果表明，50、100、150、200 μmol/L的蛇床子素药液处理人肝癌HepG2、SMMC-7721和Bel-7402细胞48 h后，与空白组相比，蛇床子素各剂量组均呈现出抑制人肝癌细胞生长的效应，细胞活力显著降低，呈现一定的浓度依赖性，且具有良好的IC50值，见图1。

图1 蛇床子素化学结构及其对HepG2、SMMC-7721和Bel-7402细胞活力的影响

2.2 蛇床子素对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402增殖能力的影响 细胞克隆实验结果表明，与空白组相比，50、75、100 μmol/L蛇床子素组细胞克隆增殖菌落均显著减少（P＜0.05），呈现一定的浓度依赖性，见图2。对于人肝癌HepG2细胞， 75 μmol/L蛇床子素即表现出显著的抑制效果，而SMMC-7721和Bel-7402细胞，则在100 μmol/L表现出与 阳性对照药物5-FU（1 mg/mL）相似的抑制增殖能力。

图2 蛇床子素对HepG2、SMMC-7721和Bel-7402细胞增殖能力的影响

2.3 蛇床子素对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402迁移和侵袭能力的影响 细胞划痕实验结果表明，与空白组比，蛇床子素（100 μmol/L）组细胞在48 h、72 h迁移距离明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。SMMC-7721细胞的 Transwell小室实验结果表明，与空白组比， 50 μmol/L蛇床子素组和100 μmol/L蛇床子素组SMMC-7721细胞从上腔到下腔的迁移率明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 Transwell法测定蛇床子素对SMMC-7721细胞迁移能力的影响

2.4 蛇床子素对MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响 Western blot结果表明，与空白组比，在蛇床子素50、100、150 μmol/L影响下，人肝癌细胞HepG2与SMMC-7721中MMP-2蛋白的表达显著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白的表达显著升高（P＜0.05），并且呈现一定的浓度依赖性。见图5。

图5 蛇床子素对HepG2及SMMC-7721中MMP-2、E-cadherin蛋白表达的影响

3 讨论

蛇床子素具有抗炎[15]、抗菌[16]、抗骨质疏 松[17]、抗氧化[18]、增强免疫力[19]等多种药理学作用。蛇床子素作为一种低毒、高效的具有抗肿瘤效应的天然产物提取物和先导化合物，在抗肝癌药物的研究中受到越来越多研究者的关注，具有极其广阔的应用前景。HepG2、SMMC-7721和Bel-7704均来源于人肝癌细胞株，常被应用于新型肝癌治疗手段和治疗药物的研究。因此，为了探究蛇床子素是否在体外具有抗肝癌作用，本研究利用细胞增殖实验发现不同浓度的蛇床子素（50、100、150、200 μmol/L）在体外均可抑制人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7704的细胞活力，呈现浓度依赖性。同时利用细胞集落实验验证了蛇床子素组具有抑制人肝癌细胞体外增殖的效果，且在蛇床子素100 μmol/L的浓度条件下，给药组表现出了与5-FU（1 mg/mL）相似的抑制效果，证实了蛇床子素确实具有抗肝癌的生物活性。

肝癌细胞具有高转移能力和高复发率的特点，使得肝癌的药物治疗一直存在挑战[20-21]。本研究利用细胞划痕实验和Transwell小室实验来评价蛇床子素对于人肝癌细胞迁移侵袭作用的影响，在电子显微镜下可以观察到100 μmol/L的蛇床子素在48 h和72 h可以明显抑制人肝癌细胞的迁移和侵袭。细胞迁移相关蛋白MMP-2在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要作用，且在人肝癌细胞中高表达[22-24]。上皮细胞-间充质转化（epithelial-tomesenchymal transition, EMT）相关蛋白E-cadherin 可以保持完整的细胞连接，激活E-cadherin蛋白抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[25]。为了进一步探究蛇床子素抑制人肝癌细胞迁移和侵袭的药理机制，本研究利用Western blot实验，在分子水平上验证了蛇床子素可以抑制HepG2和SMMC-7721中细胞迁移相关蛋白MMP-2的表达以及激活EMT相关蛋白E-cadherin的表达。这提示蛇床子素抑制人肝癌侵袭的作用可能与抑制MMP-2表达以及增加E-cadherin表达有关。

综上所述，本研究采取天然产物蛇床子素作为研究对象，发现其体外具有抑制人肝癌细胞增殖和侵袭的作用，其抑制侵袭作用机制可能与抑制人肝癌细胞中MMP-2蛋白和激活E-cadherin蛋白有关，有望为肝癌的治疗提供新的药物和新的治疗方法。