多巴胺D4受体二次重复等位基因型与注意缺陷多动障碍患儿视觉功能网络的关联性

钱安丹，陶洁洁，陈双利，周荣辉，楼飞灵，王美豪

温州医科大学附属第一医院 放射科，浙江 温州 325015

注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder, ADHD）是一种通常在儿童和青少年时期诊断出的神经发育障碍性疾病，以注意力不集中和（或）冲动多动为特征，具有异质性的临床表型[1]。多巴胺D4受体（dopamine D4 receptor, DRD4）基因第3外显子48 bp可变数目顺向重复（variable number forward repetition,VNTR）被认为是影响ADHD易感性的有力候选基因，有助于改善儿童该疾病的特异性诊断[2]。最近的研究证据表明DRD4二次重复等位基因（2R）作为亚洲人群中更常见的基因亚型，与ADHD风险增加相 关[3]。DRD4不仅在人类大脑高表达，在视网膜也存在[4]，可能与视觉相关的异常更为密切。有研究表明，ADHD儿童更常被诊断为不同的视觉异常，包括屈光不正[5]、非典型眼球运动[6]、视觉处理缺 陷[7]、色觉改变等。通过一些任务态脑功能研究发现，ADHD患儿较健康对照组在视觉认知功能上也存在缺陷[8-9]，视觉网络对该疾病的分类诊断有更高的精度[10]。因此，视觉相关网络可能是ADHD患儿在遗传和行为之间的通路上潜在内表型之一，在遗传和行为之间的通路上识别可以为ADHD的神经病理机制提供重要的见解。

本研究采用独立成分分析方法（independent component analysis，ICA）对DRD4不同基因型患儿的静息状态功能磁共振成像（resting state functional magnetic resonance imaging，rsfMRI）数据进行分析，探索了视觉相关脑网络的功能连接变化，比较了视觉网络的功能连接与症状严重程度的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象 2017年2月至2020年1月间，温州医科大学附属第一医院精神科招募了124例ADHD患儿，年龄6～15岁。ADHD诊断由3名经验丰富的精神科医师按照《美国精神障碍诊断与统计手册》第五版（DSM-V）标准进行评估。两名受试者根据以下排除标准被剔除：①有器质性脑疾病史和伴有意识障碍的脑外伤史；②根据《学龄儿童情感障碍和精神分裂症现用和终生版量表》（K-SADS-PL）有精神障 碍史；③根据中国修订的韦氏智力量表，智商低于75；④曾接受过任何精神药物治疗；⑤药物依赖或药物滥用（包括海洛因、尼古丁或酒精成瘾）。本研究经温州医科大学附属第一医院临床伦理委员会批准。所有受试者自愿参与，并充分了解研究的目的、程序和潜在风险，父母或监护人签署了知情同意书。入选儿童的父母完成了SNAP-IV评定量表（SNAP-IV）评估患儿的行为及症状严重程度[11]。入选患儿完成视听整合持续性操作测验（integrated visual and auditory continuous performance test，IVA-CPT）用于衡量视觉和听觉方面的持续注意力、反应控制等[12]，共获得了6个指标：综合控制力/注意力商数、视觉控制/注意商数和听觉控制/注意商数。

1.2 基因型测定 采集患儿静脉血，用TIANGEN（DP304号）进行基因组DNA分析，然后使用PCR和短串联重复序列（short tandem repeat sequence，STR）方法对每个受试者的DRD4第3号外显子的48 bp VNTR进行基因分型。PCR反应以25 μL体积制备，每个体积包含12.5 μL KAPA2G快速复合混合物、1 μL正向引物（10 mmol/L）、1 μL反向引物（10 mmol/L）、1 μL模板DNA和9.5 μL ddH2O。样品在95 ℃加热10 min，经历多次循环后，最终在4 ℃下进行延伸。将GS500LIZ标准样品与PCR产物混合，进行HIDI电泳，获得STR图谱。

1.3 数据扫描 采用美国GE Signa-HDx 3.0Tesla磁共振扫描仪进行全脑扫描成像。先采集T2加权图像为排除颅内结构性病变，再使用回波平面成像序列（echo plane imaging sequence，EPI）采集rs-fMRI数据，成像参数如下：TR/TE=2 000/26 ms； FOV=192 mm×192 mm；矩阵=64×64；翻转角度（FA）= 90°；层厚=4 mm；层间距=0 mm；层数33层；240个体积。在rs-fMRI扫描期间，要求所有受试者闭上眼睛，戴上海绵耳塞，尽可能保持静止，保持清醒，避免思维活动。为确保患儿的安全，在监护人的陪同下进行全程扫描。

1.4 数据预处理 rs-fMRI数据预处理采用DPABI（http://rfmri.org/dpabi）和MATLAB平台。预处理步骤包括：①剔除前10个扫描时间点；②时间校正；③头动校正：去除头部运动三维平移超过3.0 mm 和（或）三维旋转超过3°和（或）FD值（frame-wise displacement measurements，FD）不超过0.5的19个受试者数据；④图像在空间上标准化为标准模板（montreal neurological institute，MNI），并重新采样体素大小为3 mm×3 mm×3 mm；⑤标准化的fMRI数据用4 mm×4 mm×4 mm半高全宽（full width half-maximum，FWHM）高斯核进行平滑处理，以适应受试者间的解剖变异。

1.5 独立成分分析 独立成分分析是一种数据驱动的分析rs-fMRI数据的方法。采用fMRI工具包中的组ICA（MICA beta1.22，http://www.nitrc.org/projects/cogicat/）可获得更稳定的结果。MICA进行数据分析的三个主要阶段：①数据降维；②ICA算法的应用；③每个个体的图像与时间序列重建。在本研究中，采用SOI-GICA算法并进行了100次GICA，根据之前的研究[13]，每个受试者获得了30个独立成分。对剔除成分的肉眼识别表明，它们可能与眼球运动、头部运动或心跳引起的搏动有关。通过肉眼识别的金标准确定三个与视觉相关的组成部分，包括内侧视觉网络（成分18）、枕极视觉网络（成分22）、外侧视觉网络（成分15），这三个部分在网络节点方面与先前的研究[13-14]高度一致。在进行组间比较之前，获取受试者特定的全脑空间地图并转换成Z分数。

1.6 统计学处理方法 从所有受试者数据中提取这三个成分之后，采用MATLAB平台中的REST对每一组人的三个成分分别用单样本t检验产生各自脑网络空间地图的统计结果。单样本的特定空间地图作为后续两样本t检验分析的脑网络模板。随后，在去除性别、年龄和智商协变量之后，对每个成分的两个基因组间差异进行两样本t检验，阈值设定体素水平P＜0.05和团块水平P＜0.001（使用CDT多重比较校正）[15]。对人口统计学数据采用SPSS软件进行两样本t检验、Mann-WhitneyU检验或卡方检验比较组间差异；临床量表的相关分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 103例受试者按基因型分为两组（2R携带者组41例，其中36例2R/4R基因型，4例2R/2R基因型，1例2R/5R基因型；2R非携带者组62例，其中52例4R/4R基因型，2例4R/3R基因型，5例4R/5R基因型，3例4R/6R基因型）。两组人群基因型处于Hardy-Weinberg遗传平衡法则。两组在年龄（P=0.594）、智商（P=0.533）或性别分布（P=0.388）方面差异均无统计学意义，见表1。

表1 DRD4 2R携带者组与2R非携带者组的临床特征

2.2 不同DRD4基因型视觉功能网络ICA功能连接强度的差异 以年龄、性别、智商作为协变量，DRD4 2R携带者组和2R非携带者组之间的差异为：与2R非携带者组相比，2R携带者组外侧视觉网络中右侧颞枕叶（MNI峰值坐标：x=33，y=-69，z=12）的连接强度趋于增强（P=0.003），右侧中央前回（x=51，y=3，z=45）的连接强度下降（P＜0.001），右侧扣带回前部（x=3，y=21，z=42）的连接强度趋于下降（P= 0.001）。2R携带者显示内侧视觉网络中右侧枕上回（x=21，y=-87，z=21）连接强度趋于增强（P=0.009），左侧小脑上部（x=-27，y=-45，z=-21）的连接强度趋于下降（P=0.003），见图1与表2。枕极视觉网络中两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 DRD4 2R基因型携带者组与2R基因型非携带者组之间的视觉脑功能网络连接差异

图1 DRD4 2R基因型携带者组与2R基因型非携带者组之间的视觉功能网络脑区差异（彩带代表t值）

2.3 两组显著差异脑区（右侧颞枕叶、枕上回）的功能连接强度与临床量表的相关分析 在右侧颞枕叶脑区，SNAP注意不集中评分与DRD4 2R携带者的功能连接强度呈正相关（r=0.339，P=0.037），与2R非携带者呈负相关（r=-0.308，P=0.016）。在右侧颞枕叶脑区，视觉注意商数（r=-0.258，P=0.043）、视觉控制商数（r=-0.251，P=0.049）、综合注意力商数（r=-0.262，P=0.040）与2R非携带者的功能连接强度均呈负相关，与2R携带者的功能连接强度呈无相关。在右侧枕上回脑区，与以上量表值的相关性均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

本研究发现，2R携带者较2R非携带者组ADHD患儿视觉相关脑区（右侧颞枕叶、楔叶、枕叶上部）的功能连接强度趋于增高，可能与视觉感觉输入的敏感性增加有关，与遗传相关的脆弱性增强有 关[14]。最新全脑分析研究发现ADHD患儿早期视觉皮层脑区（距状回、楔叶、舌回、枕叶上部）较正常儿童平均功能连接强度更高[16]。早期视觉皮层区域的连接强度增高可能与以下情况一致：ADHD患儿受到环境中视觉刺激的强烈影响，并被锁定在这些刺激中，不是很容易关注非感官任务，如持续的表演任务。神经生物学方法研究也发现使用高屏幕（电视、手机、电脑和电脑游戏）的青少年往往有较高的注意力缺陷风险评分。

本研究同时发现2R携带者较2R非携带者视觉网络右侧中央前回的连接程度下降，右侧扣带回前部的连接程度趋于下降。有研究也发现类似结果：视觉工作记忆任务状态下，ADHD患儿右侧中央前回、两侧扣带回前部激活减弱[17]；右侧扣带回白质纤维束的微观结构变化与患儿该功能下降也密切相关[18]。 视觉过程是一个复杂且精心设计的过程，不仅包括初级视觉皮层及颞枕部视觉协助皮层，也包括与其他网络之间的协调。扣带回参与多种处理过程，包括注意过程，与许多大脑区域有联系，可以彼此独立地动态活动[16]。以往荟萃分析显示ADHD患儿与注意力功能相关的脑网络表现出低激活[19]，本课题组之前的研究也发现视觉网络与额顶叶网络间的脑白质网络出现连接性降低[20]。

多动冲动症状随着年龄的增加可得到一定的控制，但注意缺陷症状更加隐匿，可持续至成年。ADHD的动物模型之一，即DRD4基因敲除小鼠，对可卡因和甲基苯丙胺的反应增强，表现出局部运动行为的增加，但注意缺陷症状的评估，在患病人群样本上更易实现。近年研究发现视觉网络在注意缺陷亚型的患者中变化更为显著[21]，多动症儿童视觉皮层脑区的功能连接性增加[22]，被认为与ADHD患者的注意力缺陷相关[23]。ADHD有效的治疗药物哌甲酯可改善临床症状，可显著减少ADHD患儿视皮层区域的局部脑血流量[23]。本研究发现，外侧视觉网络中2R携带者的右侧颞枕叶脑区功能连接强度与SNAP注意不集中评分呈正相关，2R非携带者呈负相关；2R非携带者右侧颞枕叶脑区功能连接强度与视觉注意商数、视觉控制商数、综合注意力商数呈负相关；支持以往的研究成果[17-18，24]。而内侧视觉网络的显著差异脑区（枕上回）尚未发现相关性，提示外侧视觉网络对该症状的贡献更大。外侧视觉网络主要分布于颞枕部视觉协助皮层，协助早期视觉皮层网络对信息的处理。右侧颞枕叶脑区为神经发育障碍儿童面部识别的关键脑区[9]，也是视觉注意过程的关键节点，与注意缺陷症状严重程度相关，进一步提示2R基因型有更显著的注意缺陷症状，与先前研究[25]一致。

本研究尚存在一定不足与局限。首先，只有ADHD患儿被招募在本研究中，这限制了进一步解释本研究成果。将来的研究应采用病例对照研究方法来验证DRD4 2R基因型对ADHD的作用，并且提供更多有价值的临床联系。其次，由于部分实验结果未通过多重比较矫正，结果只代表有变化趋势，因此结论应该谨慎。最后，尽管ADHD的表现形式和亚型分析之间可能存在着深刻的差异，但由于样本量小和每组受试者数量不平衡，无法进行亚型分析。尽管如此，DRD4 2R基因型对ADHD患儿视觉网络的初步分析可为进一步的深入研究提供基础和依据。

综上所述，ADHD是复杂的异质性疾病，DRD4 2R基因型可影响视觉网络中右侧中央前回、颞枕叶等脑区。2R携带者患儿的视觉网络中右侧颞枕叶脑区功能连接增强，且与SNAP注意不集中评分呈正相关，而显示出更显著的注意缺陷症状。这一研究发现扩展了对ADHD神经病理机制的现有理解，从基因-脑-行为的研究过程探讨ADHD的视觉功能神经网络，发现2R携带者的视觉网络变化模式可能是注意力缺陷的神经病理基础之一。