MRI水通道蛋白分子成像评估肾脏缺血再灌注损伤的可行性研究

张志平 罗凯 陈沁 陈婧 张京刚 陈杰 邢伟

肾脏缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是肾功能衰竭的常见原因，主要发生于肾移植、部分性肾切除、肾动脉成形术以及复杂的心血管手术后。这种损伤可导致肾功能迅速下降，明显增加病人的死亡率[1]。因此，早期诊断和及时干预对于延长病人的生存期至关重要。MRI水通道蛋白（aquaporin，AQP）成像作为新兴的无创性成像技术，在体素内不相干运动（intravoxel incoherent motion，IVIM）成像基础上引入更多、更高b值，是一种超高b值DWI成像技术。基于三指数模型的MRI-AQP成像不仅可以获得组织血流灌注信息和细胞外水分子扩散信息，其衍生的参数超高b值ADC（ADCaqp）还可以反映细胞膜上AQP的表达和功能，因此可以从分子水平特异性地反映细胞的生理和病理变化[2-4]。近来年，MRI-AQP分子成像技术应用的研究越来越多，特别是在中枢神经系统疾病方面的应用取得了一定的进展[5-6]。Wang等[7]首次使用ADCaqp评估大鼠早期2型糖尿病肾病的肾损害，发现ADCaqp与肾脏AQP2表达变化相关。但目前为止，MRI-AQP在肾脏方面的应用研究还较少，在肾脏IRI方面的研究尚未见报道。本研究旨在探讨MRI-AQP分子成像评估兔肾脏IRI的可行性及价值。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 选取健康雌性新西兰大白兔30只（由苏州大学动物中心提供），体质量为2.0～2.5 kg。随机分为5组，每组6只。其中1组作为对照组，行IRI假手术，即术中分离肾蒂但不夹闭。另外4组作为实验组，采用无创血管夹夹闭左侧肾蒂60 min后再灌注建立IRI模型，首先按1mL/kg体质量肌内注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉，麻醉后取右侧卧位固定，左肾区备皮、消毒，切开左侧腹壁充分暴露左肾，分离兔的左侧肾蒂，用无创血管夹夹闭阻断其血供，制作缺血模型。以36℃生理盐水浸泡的纱布覆盖伤口，6 min后松开血管夹，恢复左肾血流，此时肾脏由暗红色转成鲜红色，再灌注模型制作成功，关腹缝合。对照组于假手术后行MRI检查，其余4组分别于IRI后1、12、24、48 h行MRI检查（依次为IRI后1、12、24、48 h组）。本实验方案经苏州大学第三附属医院动物实验委员会批准。

1.2 MRI检查方法 采用美国GE Discovery Silent 3.0 T超导MR扫描设备，12通道相控阵柔性线圈。扫描范围覆盖左肾区。扫描序列及参数：①横断面T2WI：TR/TE 1 807 ms/85 ms，FOV 14 cm×14 cm，层厚4.0 mm，层间距1.0 mm，矩阵256×224，带宽31.25 Hz，扫描时间1 min 52 s；②MRI-AQP成像：采用平面回波（EPI）序列进行横断面多b值DWI扫描，选择18个b值（0、50、100、150、200、300、500、800、1 000、1 300、1 500、1 700、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 s/mm2），TR/TE 2 000 ms/112 ms，FOV 11 cm×11 cm，层厚4.0 mm，层间距0.3 mm，矩阵64×32，带宽125 Hz，扫描时间6 min 22 s。

1.3 图像后处理 在GE AW 4.7工作站上进行数据后处理。2名高年资影像诊断医师在不知实验兔分组和病理结果的情况下独立测量，以T2WI影像为参照，在横断面DWI b0影像上选取肾门水平为测量层面，沿着左肾皮质和外髓边缘手工勾画兴趣区（region of interest，R OI），避开出血及伪影，然后映射到各参数图上获得肾脏皮质、外髓质的标准ADC值（standard ADC，ADCs）、纯扩散系数（D）、伪扩散系数（D*）和灌注分数（f）值、AQP扩散系数(ADCaqp)，其中，ADCs为b=0和1 000 s/mm2时利用单指数方程获得；D、D*、f为b＜1 700 s/mm2时利用双指数方程获得；ADCaqp是将7个超高b值（1 700、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 s/mm2）和b0拟合到单指数方程获得。以2名医师测量的平均值进行后续分析。

1.4 病理学检查 实验兔于MRI影像采集后处死，分离左肾并取出后用36℃生理盐水反复冲洗。将肾脏组织置于10%的中性福尔马林溶液固定24 h，乙醇冲洗、脱水，石蜡包埋，然后采用石蜡组织切片机垂直于肾脏长轴连续切片，厚度约为4μm，采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色，观察其病理表现。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据分析。数据分布的正态性检验采用Kolmogorov-Smirnov检验。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组与对照组T2WI影像表现 在T2WI上，对照组肾脏皮髓质各层次分界清晰，表现为外髓明显低信号，内髓和皮质呈高信号。IRI后1 h组的肾实质肿胀，皮质信号增高，外髓低信号带增宽、模糊；IRI后12、24、48 h组的皮、髓质分界逐渐清楚（图1）。

2.2 对照组和实验组的DWI参数比较 IRI后1、12、24、48 h组 和 对 照 组 的 各 参 数（ADCs、D、f、ADCaqp）的差异均有统计学意义（P<0.05，表1）。与对照组相比，IRI后1 h组皮质和外髓的ADCaqp均升高，IRI后24 h和48 h组均降低（均P<0.05）；24 h组与48 h组间ADCaqp值差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，IRI后各组皮质与外髓的ADCs、D、f值均有不同程度降低，以IRI后1 h组降低最明显（P＜0.05）。IRI后24 h组与对照组间皮质的ADCs、D值差异无统计学意义（均P＞0.05），IRI后48 h组与对照组间外髓的f值差异无统计学意义（P＞0.05），其余IRI后各组与对照组间皮质、外髓的ADCs、D、f值差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 5组间肾脏皮髓质DWI参数值的比较 n=6

2.3 病理表现 对照组左肾肾小球形态、结构正常，肾小管管腔清晰，间质无水肿、充血。IRI后1 h组的肾小管上皮细胞明显肿胀，部分呈气球样变性，小管周围毛细血管及直血管受压，肾间质水肿、少量出血。IRI后12 h组的肾小球囊扩张，肾小球皱缩，肾小管管腔可见扩张、少量蛋白管形，刷状缘部分丢失，少数上皮细胞凝固性坏死，肾间质内少量炎细胞浸润。IRI后24 h、48 h组的肾小球囊显著扩张，肾小球明显皱缩，肾小管上皮细胞水肿减轻，细胞损伤进一步加剧，细胞坏死、凋亡，部分脱落，管内出现蛋白管型、红细胞管型，刷状缘消失，肾间质见较多的炎细胞浸润（图1）。

图1 对照组及实验组的T2WI、DWI（b=1000 s/mm2）、ADCaqp参数图及病理图（HE，×400）。T2WI显示IRI后1 h组的肾脏肿胀，皮髓质分界不清；ADCaqp参数图显示IRI后1 h组的肾脏皮髓质呈明显红色，IRI后12、24、48 h组的皮髓质变黄变绿。病理图显示IRI后1 h组的肾小管上皮细胞明显肿胀、间质水肿；12 h组的上皮细胞凝固性坏死（箭头）；IRI后24 h组的多个肾小管管腔内出现蛋白管型（▲），48 h组的上皮细胞凝固性坏死、凋亡，部分脱入管腔（短箭头）。

3 讨论

传统的DWI原理是基于水分子自由扩散实现跨膜转运，实际上水分子实现跨膜转运包括自由扩散和通过细胞膜上的AQP主动转运。AQP是细胞膜上具有高度选择性的跨膜转运蛋白族，在调节细胞膜的通透性和维持细胞内外水平衡方面发挥着重要作用[8-9]。既往研究[10-11]表明，通过超高b值DWI得到的ADCaqp值可以反映细胞膜上AQP的表达和功能。在肾脏中，AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7、AQP11等8个AQP在不同片段和不同细胞中表达，参与了多种肾脏疾病的发生与发展，包括急性肾损伤、糖尿病肾病、肾细胞癌、肾纤维化[12]。本研究采用MRI-AQP三指数模型从肾脏血流灌注、组织扩散、AQP跨膜转运多方面定量评估肾脏IRI的动态变化，并与病理进行对照。

3.1 ADCaqp可能反映了IRI后AQP的表达 随着b值的增加，水分子的扩散速率明显降低，而细胞膜中的AQP是水扩散的主要抑制剂，因此通过测定水分子跨膜转运速率可以间接反映细胞膜上AQP表达的变化[5]。

IRI后1 h肾脏皮髓质的ADCaqp值明显升高，与对照组相比差异有统计学意义，我们考虑ADCaqp的变化可能与AQP的表达上调有关。IRI后1 h是再灌注损伤的起始阶段，缺血肾组织从有氧代谢转变为无氧代谢，细胞内三磷酸腺苷(ATP)水平急剧下降，由此导致乳酸依赖性ATP的产生增加，从而加剧细胞酸中毒；同时，细胞膜上的Na+/K+ATP酶活性受到抑制，细胞内的钠迅速积累，破坏了细胞内外正常的渗透压并可能诱导细胞膜上AQP表达增多，促进细胞外水分子进入细胞内，进而导致细胞水肿[13-14]。本研究的病理结果也证实IRI后1 h细胞水肿最显著。

IRI后12 h ADCaqp值开始下降，24 h降低至最低水平，考虑可能与细胞膜上AQP表达下调有关。既往研究[15-16]报道，肾脏IRI后细胞膜上多种AQP表达明显下调，这也是导致尿液浓缩的主要原因。Jung等[17]研究结果也表明AQP2在兔肾脏IRI后24 h明显降低，并持续至48 h。然而，IRI后AQP表达下调的原因尚不明确，可能是由于机体自我保护机制下调AQP的表达，限制更多的水分子扩散进入细胞内从而减轻了细胞水肿，也可能随着IRI后时间的延长，肾小管细胞坏死逐渐加重导致了AQP表达减少。

3.2 ADCs、D、D*、f可以反映IRI后肾小管和微血管的损伤 IRI建模后1 h组的ADCs及D值与对照组的相比明显降低，此时细胞水肿最明显，细胞外水分子扩散运动受限。肾小管的坏死和凋亡是IRI的主要特征，IRI后肾脏的氧供需不平衡导致氧化代谢的降低，进而导致小管上皮细胞进行性损伤和坏死[18]。随着IRI后时间的延长，肾小管细胞坏死、凋亡逐渐加重，坏死区细胞密度降低，水分子的扩散运动增强，可能是导致ADCs及D值在IRI后12 h、24 h逐渐升高的原因，但仍低于对照组；而IRI后48 h ADCs、D值下降，考虑与炎症细胞的浸润增多、细胞密度增加有关，因此推测ADCs及D值的变化是细胞水肿、坏死、间质炎症等综合作用的结果。f值反映了组织的血容量，于IRI后1 h下降，其原因可能包括：IRI损伤后血管反应性收缩；小管周围毛细血管及直血管受肿胀的细胞压迫变细；缺血后血管内皮细胞损伤，再灌注可引起血管内膜肿胀、管腔狭窄，血流进一步减少[19]。IRI后12 h，f值接近正常，可能是出于机体自我保护机制引起血管反应性扩张。

3.3 小结 本研究仍有一定的局限性。鉴于本研究样本量较小，后期应继续增大样本量，使测量结果更稳定、精确。另外，由于血液、生化等实验室检查指标不能反映分肾功能，故本次研究未纳入常规检查。本研究没有对肾脏主要表达的AQP进行定量分析，后续可以结合免疫组化、蛋白印迹等方法对AQP进一步定量分析，深入探究肾脏IRI后ADCaqp值和AQP表达之间的相关性。

总之，MRI-AQP三指数模型可以从细胞和分子水平反映肾脏IRI的动态变化,通过超高b值获得的ADCaqp可以反映IRI后细胞膜上AQP的表达水平和功能。因此，ADCaqp作为一种新的影像学生物标志物对于进一步探讨IRI的病理生理机制具有重要意义。