基于网络药理学与分子对接探究银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的作用机制

万一鸣，李云鹏，桑海强

(郑州大学第一附属医院 心血管内科，河南 郑州 450052)

动脉粥样硬化是一个以血管内皮细胞损伤为基础，以血管壁炎症和脂质浸润为特征的病理过程，是心脑血管疾病的病理基础，对人体健康有巨大威胁[1-2]。通过建立心脑血管疾病防治与健康管理的综合防治网络，以及现代医疗科技的飞速发展，动脉粥样硬化相关性心脑血管疾病将会得到有效控制[3]，但对于动脉粥样硬化发病机制中广泛存在的氧化应激、血管内皮功能受损、炎症激活等作用尚无有效干预措施。有研究将中医药治疗该病的方法归于以下4类：活血化瘀、化痰调脂、痰瘀同治、扶正祛邪[4]。中医药也在早期防变、症状缓解、多器官同调、辅助西药疗效和预防并发症等方面积累了丰富经验，但对其作用机制和运用标准阐述尚不足[5]。

银杏被称为“活化石”，是冰河时期在地球上存活下来的一种孑遗植物[6]。银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶。银杏叶提取物具有抗氧化、清除体内自由基、抗血小板激活因子、降低血液黏度、改善微循环等多种药理作用[7]。有研究发现，银杏叶提取物可以通过参与NF-κB信号通路降低炎症因子水平进而调控炎症过程[8]。银杏叶滴剂可通过调控Nrf 2/ARE通路改善氧化应激状态[9]。此外，银杏叶提取物具有抗脂质过氧化作用，还可清除氧自由基，可有效改善患者血管内皮功能[10]。本文旨在通过网络药理学和分子对接技术研究银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的作用机制，为临床应用进一步提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 银杏叶活性成分与作用靶点的筛选在中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中检索银杏叶中的化学成分，利用指数OB≥30%和DL≥0.18筛选有效成分[11]。利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得典型SMILES信息上传到Swiss Target Prediction 靶基因预测平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)收集活性成分对应的靶点蛋白[12]，同时利用GeneCards人类基因数据库平台(https://www.genecards.org/)收集活性成分对应的靶点蛋白，通过UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库对基因信息标准化处理，并剔除无“homo sapiens”和“reviewed”UniProt ID的基因，从而获得活性成分的潜在作用靶点。

1.2 动脉粥样硬化相关靶基因的收集利用DisGeNET疾病相关的基因与突变位点数据库(https://www.disgenet.org/)(score≥1)和GeneCards人类基因数据库平台(相关度≥5)[13]检索“动脉粥样硬化”的相关靶基因，合并2个数据库去除重复靶点后，再上传至UniProt数据库得到对应基因的名称，从而得到疾病的靶点。

1.3 银杏叶活性成分与动脉粥样硬化共同靶点的确定将上述操作获得的活性成分的潜在作用靶点和疾病的靶点上传至Venny 2.1.0 (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制Venny图，确定共同作用的靶点，并找到共有靶点对应的化合物，所得的交集靶点即为银杏叶提取物有效活性成分可能作用于动脉粥样硬化的相关靶点。

1.4 构建蛋白互作网络与核心靶点网络将银杏叶活性成分-动脉粥样硬化共同作用的靶点上传到Version 11.0的STRING平台(https://string-db.org/)[14]，选择“Multiple protein”，蛋白种属设置为“Homo sapiens”，设置高置信度为“highest confidence(≥0.900)”，其他参数保持默认值，获得相关度最大的蛋白相互作用关系网络图与数据，其数据保存TSV格式文件，将所得的数据文件导入Cytoscape 3.8.0软件中，并用Analyze Network工具绘制构建银杏叶治疗动脉粥样硬化的蛋白互作网络，利用其插件CytoNCA获取核心靶点网络。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析将共同作用靶点基因上传到DAVID数据库Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)中，勾画上Multi-List File和Gene List，标识符设置为OFFICIAL_GENE_SYMBOL，在List和background栏均选择Homo sapiens，进行GO和KEGG通路富集分析，并对结果使用线上制图工具微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)[15]和OmicShare平台(https://www.omicshare.com/)[16]进行图像可视化处理，分别绘制GO功能富集和KEGG通路富集图。

1.6 “活性成分-靶点-疾病”网络模型构建与分析将药物有效活性成分、交集靶点及疾病导入Cytoscape 3.8.0软件，用该软件的Network Analyzer工具计算网络拓扑参数，构建“活性成分-靶点-疾病”网络图，网络中的一个节点的度值表示与该节点有相互作用的节点数目，度值越大则表示与该节点有相互作用的节点越多，在治疗动脉粥样硬化中起到的作用越大。

1.7 “活性成分-核心靶点”分子对接进行分子对接来验证预测的可靠性。先在UniProt数据库中依据“Reviewed”“Human”分别对核心靶点筛选出靶点蛋白，再根据蛋白三级结构特性“Resolution、Method、配体数、Chain”筛选出最佳蛋白结构，从PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载该蛋白的三级结构。另外用PubChem CID获取活性成分2D结构的SDF文件，上传至Chem 3D转换为活性成分3D结构的mol2文件。接着通过PyMOL软件(http://www.pymol.org)剔除核心靶点蛋白中的配体和非蛋白分子，用AutoDock软件加氢、加电荷、合并非极性氢等操作后保存成PDBQT文件，然后在AutoDock Tools 1.5.6和AutoDock Vina软件中完成分子对接，最后用PyMOL软件将结果可视化处理。

2 结果

2.1 银杏叶活性成分与作用靶点的筛选通过TCMSP数据库共收集到307个银杏叶中的化学成分，以OB≥30%和DL≥0.18为条件，筛选出27个可能具有高效活性的成分，结果见表1。通过GeneCards和Swiss Target Prediction数据库收集靶点，共收集到4 253个化合物靶点，经UniProt数据库转换为标准基因名称，并剔除无“homo sapiens”和“reviewed”UniProt ID的基因，去重后得到银杏叶活性成分潜在作用靶点有1 376个。

表1 银杏叶中27个活性化合物的基本信息

2.2 动脉粥样硬化相关靶基因的收集从DisGeNET数据库(score≥1)和GeneCards人类基因数据库平台(相关度≥5) 检索到“动脉粥样硬化”的相关靶基因共524个，去重后有441个，从而得到疾病的靶点。

2.3 银杏叶活性成分与动脉粥样硬化共同靶点的确定将银杏叶中27个活性成分的1 376个靶点与动脉粥样硬化相关的441个靶基因用Venny 2.1.0在线制图功能绘制Venny图，见图1。两者取交集后得到163个化合物-疾病共有靶点，这些靶点是银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的潜在作用靶点，找到共同靶点对应的化合物。见表2。

左图为活性成分靶点个数，右图为动脉粥样硬化靶点个数。

表2 共有靶点对应的活性成分

表2(续)

2.4 银杏叶活性成分-动脉粥样硬化共有靶蛋白之间的蛋白互作网络与核心靶点网络分析将银杏叶活性成分与动脉粥样硬化共有的靶点导入STRING在线平台，将所得的数据文件导入Cytoscape 3.8.0软件中，并用Analyze Network工具绘制相互作用网络，如图2所示。结果显示，该PPI网络中集聚系数最大值为1.000，介数中心性为0.143，度值最大值为28。网络中共有125个节点，418条相互关联的边，节点代表靶点蛋白，边代表蛋白间相互关联。节点的大小和颜色表示度值的大小，节点越大，度值越大，同样的颜色越深，其度值越大。度值越大，表示该靶点与银杏叶治疗动脉粥样硬化的机制相关性越强。利用其插件CytoNCA获取核心靶点网络，如图3所示，PDGFRB、MAP2K1、HRAS、IL6、PTPN11、VEGFA、PIK3CA是银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的关键靶点，同时也表明银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化是多个靶蛋白共同发挥作用的。

图2 银杏叶治疗动脉粥样硬化的蛋白互作网络

图3 核心靶点网络

2.5 GO功能富集分析GO分析包括生物过程(biological process，BP)、细胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)3个部分，共同描述基因产物的功能。利用线上工具DAVID，通过GO项下的插件对银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的163个潜在靶点进行GO富集分析，根据3个插件(GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT)共获得745个条目，其中BP条目586个、CC条目56个、MF条目103个。再根据P值从小到大进行排序，选取前10条GO条目，对P值进行-log10数据转换(P=0时，设置为10)，通过微生信平台进行图像可视化处理，绘制GO功能富集分析图，见图4。GO分析结果显示，银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的生物过程主要包括胆固醇稳态、脂蛋白代谢过程、胆固醇外流、胆固醇逆向转运、胆固醇代谢过程等；细胞成分主要包括细胞外空隙、胞外区、细胞表面等；分子功能主要包括蛋白质同二聚化活性、胆固醇转运蛋白活性等。这说明银杏叶提取物在生物过程、细胞成分及分子功能方面与动脉粥样硬化的发生和进展紧密相关。

BP为生物过程，绿色横坐标从左到右依次为胆固醇稳态、脂蛋白代谢过程、胆固醇外流、胆固醇逆向转运、胆固醇代谢过程、高密度脂蛋白颗粒重塑、基因表达的正调控、低密度脂蛋白颗粒重塑、对药物的反应、炎症反应；CC为细胞成分，黄色横坐标从左到右依次为细胞外空隙、胞外区、细胞表面、溶酶体、细胞外泌体、质膜、乳糜微粒、早期内涵体、极低密度脂蛋白颗粒、高密度脂蛋白颗粒；MF为分子功能，蓝色横坐标从左到右依次为蛋白质同二聚化活性、胆固醇转运蛋白活性、蛋白质结合、酶结合、胆固醇结合、相同的蛋白质结合、细胞因子活性、肝素结合、磷脂结合、脂质结合。

2.6 KEGG通路富集分析利用线上工具DAVID，通过Pathways项下的插件对银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的163个潜在靶点进行KEGG通路富集分析，根据插件(KEGG-Pathway)共获得105条通路，取P值从小到大排名前20的数据，通过OmicShare平台绘制KEGG气泡图，见图5。Y轴表示通路名称，X轴表示富集度。主要通路有PPAR信号通路(图6)、TNF信号通路(图7)、Proteoglycans in cancer信号通路以及Non-alcoholic fatty liver disease信号通路等。结果表明，银杏叶提取物有效活性成分可能通过调控这些信号通路作用于动脉粥样硬化。

图5 KEGG通路富集分析

图6 PPAR信号通路

图7 TNF信号通路

2.7 “活性成分-靶点-疾病”网络模型构建利用软件Cytoscape 3.8.0将有效活性成分、共有靶点以及疾病构建可视化网络，见图8。结果显示，网络中共有188个节点，799条相互作用的边，红色代表动脉粥样硬化，蓝色代表银杏叶提取物的活性成分，紫色代表共有靶点，边代表两者的相互作用。其中度值排名靠前的活性成分依次是槲皮素、亚麻酸乙酯、油酸乙酯等。这些成分可能是银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的关键活性成分，活性成分的作用靶点越多代表其与动脉粥样硬化的治疗相关性越强，见图9～11。

图8 “活性成分-靶点-疾病”网络

图9 油酸乙酯

图10 亚麻酸乙酯

图11 槲皮素

2.8 “活性成分-核心靶点”分子对接将2.4项下得到的核心靶点PDGFRB、MAP2K1、HRAS、IL6、PTPN11、VEGFA、PIK3CA分别与各自对应的活性成分进行分子对接和结合能力预测。分子对接结合自由能越小，则表示受体与配体之间的亲和力越大，构像越稳定，见表3。用PyMOL软件对其进行可视化处理，见图12。结果显示，所有对接结合能均小于0，表明所有核心靶点与活性成分的分子对接结合自由能均较小，即具有较好的亲和力，其中槲皮素-HRAS的亲和力最大，山柰酚-VEGFA次之。

表3 核心靶点-活性成分结合能

图12 “活性成分-核心靶点”分子对接

3 讨论

近10年，陆续有通过网络药理学预测银杏叶治疗心绞痛、高脂血症、高血压机制的相关研究，以及探究银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的作用机制的临床和动物实验的相关研究，然而，尚无从网络药理学的角度预测银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的作用靶点和机制的研究。根据专家共识，动脉粥样硬化的主要证候包括痰瘀互结证、气阴两虚证、气虚血瘀证和气滞血瘀证[17]。银杏叶具有活血化瘀、敛肺平喘之效果，中医主要用于治疗肺虚咳喘、胸痹心痛等，是治疗动脉粥样硬化的潜在药物[18]。本研究借助网络药理学对银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的作用机制进行了系统性的初步探索，希望能为动脉粥样硬化的预防和治疗提供理论依据和新思路。

通过Cytoscape 3.8.0将“活性成分-靶点-疾病”网络可视化分析，得知槲皮素、亚麻酸乙酯、油酸乙酯可能是关键成分。已有研究表明，槲皮素可以通过调控MALAT1/miR-494-3p/PTEN轴来抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL)诱导的氧化应激，进而提高细胞活力[19]。槲皮素还可以通过上调血红素加氧酶-1的表达，有效抑制血管内皮细胞NADPH氧化酶衍生的活性氧簇形成和氧化剂诱导的内皮功能障碍[20]。与甘油三酯型α-亚麻酸相比，乙酯型α-亚麻酸降低血清胆固醇效果更显著[21]。同时α-亚麻酸乙酯还能有效降低非酒精性脂肪性肝病患者的血清甘油三酯和胆固醇水平，并且明显提高患者血清脂联素水平[22]。由此可见，银杏叶提取物的关键活性成分(槲皮素、亚麻酸乙酯、油酸乙酯)在动脉粥样硬化治疗中发挥了重要作用。

在银杏叶治疗动脉粥样硬化的蛋白互作网络中，筛选出银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的核心靶点主要包括HRAS、VEGFA、PTPN11、PIK3CA、MAP2K1、IL6、PDGFRB。有研究表明，HRAS是组织中分布最广泛的RAS，调节多个膜受体和下游信号转导系统之间的信号传递[23]。其参与Ox-LDL诱导的内皮细胞HSFI和PAI-I的上调[24]，也调节过氧化氢诱导的内皮细胞氧化应激过程[25]，同时也被证明是木犀草素抗炎的核心靶点[26]。VEGFA是血小板衍生生长因子家族的成员，具有增强血管通透性、诱导血管生成以及促进细胞迁移和抑制细胞凋亡等作用[27]。另外，血小板微粒可通过miR-4306激活VEGFA/ERK1/2/NF-κB信号，诱导细胞凋亡，引起内皮细胞生长因子表达下降[28]。本研究结果显示，银杏叶提取物可通过参与抗氧化应激、抑制炎症激活、调节血管内皮细胞的凋亡和功能障碍等来发挥治疗动脉粥样硬化的作用。

KEGG信号通路富集分析显示，银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的主要通路有PPAR信号通路、TNF信号通路、Proteoglycans in cancer信号通路以及Non-alcoholic fatty liver disease信号通路等。沉默MAP4K4可通过激活PPARγ/ABCA1信号通路抑制细胞凋亡和氧化应激减轻血管内皮细胞损伤[29]。丹参酮ⅡA可通过调控TNF-α/p38MAPK/ NF-κB/ RBP4信号通路来发挥调节血脂和抗动脉粥样硬化的作用[30]。值得注意的是，近些年探讨“内皮功能与动脉粥样硬化的关系”成为了热点。有研究表明银杏叶提取物活性化合物通过雷帕霉素靶蛋白和NF-κB信号通路抑制动脉粥样硬化[31]，但雷帕霉素靶蛋白信号通路却不是网络药理学预测得到的主要通路。这给我们以启示，研究作用机制不应只聚焦于主要通路，银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化是通过多通路发挥作用。

“活性成分-核心靶点”分子对接结果显示槲皮素-HRAS、山柰酚-VEGFA等均展现出较好的亲和力，构象稳定，有强烈的结合能力，也进一步验证了本研究网络药理学的预测，银杏叶提取物可能通过多成分作用于多靶点而影响动脉粥样硬化的发生、发展。

综上所述，本研究应用网络药理学和分子对接技术推测，银杏叶提取物可能通过槲皮素、亚麻酸乙酯、油酸乙酯等27个活性成分作用于PDGFRB、MAP2K1、HRAS等163个靶点，调控PPAR信号通路、TNF信号通路、Proteoglycans in cancer信号通路以及Non-alcoholic fatty liver disease信号通路等，参与抗氧化应激、抑制炎症激活、调节血管内皮细胞的凋亡和功能障碍等多方面生物过程，发挥对动脉粥样硬化的治疗作用。

本研究是第1个从网络药理学角度系统地预测了银杏叶提取物治疗动脉粥样硬化的作用机制的研究，在一些方面还有不足。首先，事实上药物的不同成分所占百分比不同，且有的成分间还有协同或拮抗等相互作用，本文在对靶点进行富集分析时未能兼顾；其次，文中只用了2个数据库搜集动脉粥样硬化有关靶点，存在遗漏相关作用靶点的可能，但本文使用的GeneCards数据库是一个整合型的生物信息数据库，该数据库提供了目前已注释的、可预测的所有基因的详细信息，而DisGeNET数据库整合了公共数据库、GWAS目录、动物模型和科学文献的数据，且上述2个数据库的收据均采用了统一的标准进行注释，不需通过UniProt数据库进行基因名称的标准化转换，这些有可能规避了不规范、数据混杂的问题。目前已有IL6、HRAS、VEGFA等相关靶点以及通路的动物实验验证的报道，还有很多靶点和通路需要进一步临床和动物实验验证，这为更深入的药效物质基础分析和作用机制研究提供了方向。