中华草龟内脏油的水酶法提取及其不同部位脂质组成分析

郭晓璐，伍文彬，黄海波，李 想，胡蒋宁

(1.大连工业大学 食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034； 2.南昌大学 生命科学与食品工程学院，食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047)

中华草龟，又称乌龟、金龟等，主要分布在中国、韩国、日本等亚洲部分地区[1-2]，由于其适应性强、易繁育、寿命长，经常被用作食品和中药材，具有很高的经济价值[3-4]。中华草龟富含多种营养物质，龟肉的粗蛋白质中至少包含17种氨基酸，龟肉的脂肪中富含不饱和脂肪酸。据报道，龟蛋白肽具有多种医疗作用，可以被用作抗氧化剂和抗肿瘤剂等[5]。龟甲是一味名贵的中药，其主要含胶质、角蛋白、脂肪、钙盐等多种营养成分[6]。

目前，随着龟鳖养殖业规模的不断扩大，除了对龟甲、龟肉等有经济价值部位的传统利用外，其他部位利用率不高，大多被丢弃，在某种程度上造成资源浪费且污染环境[7]。龟鳖副产物中含有许多重要的营养成分，如蛋白质、脂类等，尤其是脂类中不饱和脂肪酸含量丰富[8]。因此，对龟鳖副产物中油脂的提取和利用有助于提高龟鳖资源的综合利用率和商业价值。

近年来，水酶法因安全、环保、设备要求低等优点[9-10]被广泛应用于植物种子中油脂的提取[11-15]，而目前还未见利用水酶法提取中华草龟内脏油(ChinemysReevesiisviscera oil，CRVO)的相关研究报道。水酶法中酶的种类与添加量、酶解温度、pH、酶解时间等因素均会显著影响提油率[16-17]。因此，有必要探索从龟鳖副产物中高效提油的水酶法条件。

通过超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱法(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)能够对脂质组成进行定性和定量分析，全面了解其营养价值并加以利用，并因其鉴定不同脂质的可靠性，以及不同组分的高效率分离和离子抑制效果小等优点而被广泛应用[18-20]。如Zhang等[21]利用此方法分析鲍鱼不同部位的脂质组成，共鉴定出10种类型，其中包括34种脂质成分，如磷脂酰胆碱(PC)、甘油三酯(TAG)等。

针对中华草龟副产物，本文采用单因素实验优化了水酶法提取中华草龟内脏油的工艺条件；同时，通过气相色谱-质谱(GC-MS)和UPLC-ESI-Q-TOF-MS对中华草龟不同部位的脂质进行全面的分析和评价，为有效提高中华草龟副产物的综合利用，延长产业链以及增加龟鳖产业的附加值提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

中华草龟，安徽蓝田龟鳖有限公司。

碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶，美国Sigma公司；甲醇、乙酸铵，均为色谱纯，大连博诺有限公司；其他试剂均为分析纯。

Agilent 7890A/5975C气相色谱质谱联用仪，美国Agilent公司；超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱联用仪，德国Bruker公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水酶法提取中华草龟内脏油

取中华草龟内脏，洗净、冻干、粉碎并真空包装，置于-4℃冷藏，并在7 d内使用。称取一定量中华草龟内脏冻干粉，添加一定量的纯净水和蛋白酶，调节至设定的温度和pH，在旋转水浴中磁力搅拌酶解一定时间后，95℃水浴10 min灭酶；取出并在7 800g离心10 min，用胶头滴管吸出上层油相，烘干至恒重并记录其质量。按下式计算提油率(Y)。

Y=ma/mb×100%

(1)

式中：ma为中华草龟内脏油的质量，g；mb为原料的质量，g。

1.2.2 脂质的提取

采用Folch法[22]从中华草龟4个部位(肌肉、内脏、脂肪块、卵)提取脂质。

1.2.3 脂质脂肪酸组成分析

分别精确称量提取的脂质0.1 g，加入2.5 mL KOH溶液(500 g/L)和5 mL乙醇(95%)，在60℃磁力搅拌下加热2 h进行皂化，然后冷却到室温用吸管吸走上层不皂化物，用3 mL正己烷洗涤下层液体6次，然后用6 mol/L HCl将下层液体pH调至2.0，再用3 mL正己烷重复提取脂肪酸；用去离子水洗涤正己烷提取物至中性，然后用吸管吸走下层水相，保留上层有机相，氮吹干燥。加入正己烷使其质量浓度为10 mg/mL，再加入2.0 mL甲基化试剂(含1% H2SO4的色谱级甲醇)。在70℃水浴中磁力搅拌1 h，随后冷却至室温并加入1 mL去离子水；静置收集上层，过无水硫酸钠后，过0.22 μm有机滤膜，进气相色谱质谱(GC-MS)联用仪进行分析，GC-MS分析条件见文献[23]。

1.2.4 脂质组成的测定

取一定量提取的脂质溶于氯仿-甲醇(体积比1∶5)中，配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，再用流动相B稀释到200 μg/mL，过0.22 μm有机滤膜，待UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析[21]。

UPLC条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C8柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相A为超纯水，流动相B为甲醇-异丙醇 (体积比85∶15) ，流动相A、B中均含有0.1%的乙酸和10 mmol的乙酸铵；洗脱梯度为0～1 min 70% B，1～6 min 70%～75% B，6～10 min 75%～85% B，10～15 min 85%～88% B，15～32 min 88%～99.9% B，32～33 min 99.9%～75% B，33～35 min 75% B；流速0.4 mL/min；柱温50℃；进样量5 μL。MS条件：采用正离子模式，质量扫描范围(m/z)50～1 500，脱溶剂气流量8 L/min，溶剂温度200℃，喷雾器压力0.2 MPa，毛细管电压4 500 V，总循环时间1.2～1.8 s。仪器通过ESI-L低浓度调谐混合物进行校准。

1.2.5 脂质种类的鉴别和定量

通过Bruker Q-TOF MS 系统采集数据，用甲酸钠校准曲线校准脂质的相对分子质量。采用开源软件MS-DIAL通过去卷积对小分子进行定性和定量，并且得到准确的相对分子质量信息。通过分析保留时间、质量精度和二级质谱与谱库(HMDB，ChEBI，FooDB)的匹配度最终实现脂质种类的鉴别。采用面积归一化法确定脂质的相对含量。通过序列方法对不同的样品、不同的平行样调整保留时间和质荷比偏差。

1.2.6 数据分析

所有实验均重复3次，结果以“平均值±标准差”表示。采用Origin9.5和SPSS16.0对实验数据进行统计分析。其中主成分分析(PCA)采用SIMCA 13.0进行统计。样品平均值之间的差异性使用Duncan法比较(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 水酶法提取中华草龟内脏油的单因素实验

2.1.1 酶的种类和酶解时间对提油率的影响

固定料液比1∶4、酶添加量0.5%(以中华草龟内脏粉质量计，下同)、酶解温度55℃和pH 7，选用4种商业酶，按1.2.1方法提取中华草龟内脏油，考察酶种类和酶解时间对中华草龟内脏提油率的影响，结果见图1。由图1可以看出，随着酶解时间的延长，4种蛋白酶的提油率均先增大后减小，碱性蛋白酶和风味蛋白酶在酶解1.0 h时提油率达到最大，分别为(66.12±0.74)%和(64.29±0.70)%。而复合蛋白酶和中性蛋白酶的提油率在酶解2.0 h达到最大，分别为(62.76±0.44)%和(67.06±1.13)%。这可能与不同类型和来源的酶对蛋白质的水解作用不同有关。酶解时间在影响提油率的同时，还影响油品的品质，长时间加热搅拌，可能会引起油品的氧化导致其品质降低。因此，综合考虑，选择碱性蛋白酶对中华草龟内脏油进行酶解提取，酶解时间为0.5 h。

图1 酶的种类和酶解时间对提油率的影响

2.1.2 酶添加量、酶解温度、pH和料液比对提油率的影响

在使用碱性蛋白酶、酶解时间0.5 h的条件下，采用水酶法提取中华草龟内脏油，考察酶添加量、酶解温度、pH和料液比对中华草龟内脏提油率的影响，结果见图2。由图2(a)可看出，随着酶添加量的增加，提油率先增加后降低，在酶添加量为0.5%时，提油率最大。当酶添加量低时，酶量不够导致提油率低；而当酶添加量增加时，酶逐渐过量，且酶与底物结合形成的复合物对酶形成反馈抑制作用，导致反应速率降低[24]，提油率降低。综合考虑，选择酶添加量为0.5%。从图2(b)、(c)可看出，随着酶解温度的升高和pH的增加，提油率呈明显的先上升后下降趋势，在55℃和pH 7时对中华草龟内脏油的提取效果最佳。由图2(d)可看出，料液比在1∶4时提油率最高，为63.56%，料液比过高和过低对提油率均有不利的影响，因为在料液比过高时存在稀释效应，在料液比过低时存在低流动性。

综合考虑，确定水酶法提取中华草龟内脏油的最优工艺条件为：选用碱性蛋白酶，酶解时间0.5 h，酶添加量0.5%，酶解温度55℃，pH 7和料液比1∶4。在最优工艺条件下，经验证实验提油率为(66.56±1.25)%。

2.2 不同部位脂质脂肪酸组成(见表1)

由表1可看出：中华草龟肌肉、内脏、脂肪块和卵脂质中共检出包括同分异构体在内的16种脂肪酸，其中C18∶1n-9的含量最高，占4个部位脂质中总脂肪酸的43.39%～50.66%；另外，含量相对较高的脂肪酸还有C16∶0(14.87%～20.82%)和C18∶2n-6(13.78%～17.40%)，同时还检出一定量的二十碳五烯酸(EPA)(0.29%～0.60%)和二十二碳六烯酸(DHA)(0.36%～0.53%)。DHA和EPA是两类重要的脂肪酸，有助于婴儿的大脑发育，并具有抗癌、抗炎和抗衰老等功效。中华草龟4个部位脂质中饱和脂肪酸含量为20.38%～29.53%，单不饱和脂肪酸含量为53.64%～64.57%，多不饱和脂肪酸含量为15.06%～18.16%。中华草龟脂质的不饱和脂肪酸含量(70.49%～79.62%)较高，接近鳟鱼鱼油(72.6%～75.3%)[25]。

表1 中华草龟卵、内脏、肌肉和脂肪块脂质的脂肪酸组成

2.3 不同部位脂质组成

按1.2.4方法对中华草龟卵、内脏、肌肉和脂肪块的脂质组成进行UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析，结果发现，所有脂质在25 min内溢出，并且甘三酯(TAG)主要在20～25 min被分离出来，而少量的鞘磷脂(SM)、磷脂(PC)和甘二酯(DAG)主要在7～14 min被分离出来，且TAG的种类和含量较多，而SM、PC和DAG种类和含量很少。图3为通过正离子模式超高效液相色谱分离质控样的质谱解卷积谱图。

图3 通过正离子模式超高效液相色谱分离质控样的质谱解卷积谱图

表2 中华草龟不同部位脂质类别的相对含量

中华草龟卵脂质中的PC含量最丰富，高达2.78%；而在脂肪块和内脏脂质中，PC含量极少，这可能是由于这两个部位中的细胞外脂质含量较高，来自细胞膜或其他部分的脂质含量低。

表3为中华草龟卵、内脏、肌肉和脂肪块脂质中主要的TAG、DAG、PC和SM 组成和相对含量。

表3 中华草龟卵、内脏、肌肉和脂肪块脂质中主要TAG、DAG、PC、SM组成和相对含量

续表3

2.4 脂质主成分分析

图4为中华草龟不同部位脂质之间相关性的PCA结果。

由图4(a)可看出，主成分1(82%)和主成分2(9%)的累积得分为91%，表明两个成分可以较好地代表整体数据。内脏脂质和脂肪块脂质形成一簇，表明这两个部位的脂质组成相似，而与卵和肌肉的脂质组成不同。结合图4(b)可以发现：PC(14∶0/21∶1)独立于其他物质之外，并且沿着与卵脂质簇矢量方向一致，表明卵脂质中该物质的含量较高；TAG(16∶1/18∶1/18∶2)、TAG(18∶2/18∶2/18∶2)和TAG(18∶1/18∶2/18∶2)形成簇并且其矢量方向表明这些物质在肌肉脂质中含量高于其他物质；TAG(16∶0/16∶0/18∶1)、TAG(16∶0/18∶1/18∶1)和TAG(18∶0/18∶1/18∶1)形成一簇且矢量方向指向内脏和脂肪块脂质，表明在内脏和脂肪块脂质中这些物质的含量较高。

3 结 论

本文首先采用单因素实验优化得到水酶法提取中华草龟内脏油的工艺条件，即以碱性蛋白酶为酶解用酶、酶解时间0.5 h、酶添加量0.5%、酶解温度55℃、pH 7和料液比1∶4，在此条件下提油率为(66.56±1.25)%。其次，分别采用GC-MS 和UPLC-ESI-Q-TOF-MS对中华草龟卵、内脏、肌肉和脂肪块脂质的脂肪酸和脂质组成进行分析，结果表明，不同部位的脂质中不饱和脂肪酸含量均较高，并含有一定量的DHA和EPA。主要脂质种类为TAG，同时含有少量DAG、PC和SM。PCA结果表明，脂肪块和内脏中的脂质成分相似，但与卵和肌肉脂质组成明显不同。本研究通过对中华草龟脂质的全面分析发现，龟鳖副产物具有作为食用油脂开发的潜力。