2017年-2019年郑州地区猪圆环病毒3型分子流行病学调查及Cap基因序列分析

刘 燕，朱金凤

(河南农业职业学院牧业工程学院,河南郑州 451450)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是养猪业中常见的病毒之一，该病毒可以感染不同阶段的猪，可以引起仔猪消瘦、关节肿胀、呼吸系统疾病及母猪繁殖障碍等一系列疾病，可以造成严重的免疫抑制，影响疫苗的免疫效果，同时可以引起其他病原的混合感染，给相关疾病的诊断与治疗带来一定困难[1-2]。PCV主要有PCV1型和PCV2型2个血清型，其中PCV1型一般不具备致病性，PCV2型可以引起仔猪一系列的疾病，具有较强的致病性[3-4]。2016年美国学者首次分离得到猪圆环病毒3型(PCV3)，随后从印度、日本及我国等多个国家均从患病猪检测到了PCV3，且PCV3可以引起猪的系统炎性疾病、皮炎肾病综合征及胎儿流产等疾病，该病已经成为造成养猪业损失的重要病因之一[5]。相关研究表明，PCV3与PCV1和PCV2具有相似的基因组结构，其基因组长度为2 000 bp，主要包含2个开放性阅读框ORF1和ORF2，ORF2基因组结构中主要编码衣壳蛋白(Cap) 和复制酶(Rep)，且Cap蛋白是PCV唯一的结构蛋白和主要抗原[6-7]。

本试验2017年-2019年采集郑州地区规模化猪场、散养猪场中患病猪的淋巴结、脾脏、肾脏及血清样品1 175份，检测PCV3流行情况，分析其选择代表株的Cap基因的遗传变异情况，为该地区猪场中PCV3流行病学调查及综合防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2017年-2019年采集郑州地区猪场中患病猪的淋巴结、脾脏、肾脏及血清样品1 175份，其中2017年采集379份，2018年采集395份，2019年采集401份。

1.1.2 主要试剂 病毒DNA提取试剂盒、琼脂糖DNA回收试剂盒、DNA标准DL 2 000、ExTaqDNA聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 多功能PCR仪、凝胶成像仪，ThermoFisher公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因组DNA的提取 将采集的病料样品组织加入等量的无菌的PBS均浆，在-80℃反复冻融3次～5次，离心后取上清，用0.2 μm过滤后加入10 mg/mL双抗处理0.5 h，参照病毒DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。置-80 ℃保存备用。

1.2.2 PCV3的PCR鉴定 参考文献[8-9]，参照GenBank中登录的基因序列，设计PCV3特异性鉴定引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用1.2.1中提取的病毒基因组DNA为模板进行PCR鉴定，回收PCR产物，连接到18T提取质粒进行测序，与GenBank中登录的PCV3参考株进行同源性比对。

表1 引物序列

1.2.3 PCV3的Cap基因检测与测序 参照文献[10]，设计PCV3Cap基因引物(表1)。用1.2.1中提取的病毒基因组DNA为模板，挑选代表毒株进行Cap基因检测，回收PCR产物，连接到18T提取质粒进行测序，分析其遗传变异情况。采用DNAMan软件和MEGA6软件与GenBank登录的PCV3参考株的Cap蛋白基因序列进行对比分析，构建系统进化树。

2 结果

2.1 PCV3的PCR检测结果

用PCV3特异性鉴定引物对采集的样品进行PCR鉴定，部分样品均扩增出大约为330 bp大小的目的条带(图1)，阳性的样品连接T载体测序后，其测序结果与GenBank中登录的PCV3参考株同源性在均大于97.0%。

M.DNA 标准DL 2 000;1～5.部分样品

2.2 病料的PCV3检测结果

对2017年-2019年采集采集郑州地区猪场中患病猪样品1 175份进行PCV3检测，结果由表2可知，2017年-2019年的PCV3总阳性率为14.6%，2017年、2018年和2019年的阳性率分别为9.5%、14.4%和19.5%，其中以2019年阳性率最高，呈现逐年升高的趋势。

表2 PCV3型检测结果

2.3 PCV3的Cap基因检测与测序结果

对2017年-2019年采集郑州地区猪场中患病猪样品中检测出PCV3阳性样品中选择8个代表株进行Cap基因PCR检测，采用DNAMan软件和MEGA6软件与GenBank 登录的PCV3参考株的Cap蛋白基因序列进行对比分析，构建系统进化树，结果显示，8个代表株PCV3均扩增到Cap基因，与预期的大小相符(图2)。8个代表株PCV3Cap基因序列与GenBank登录的12株参考株的同源性在92.%～100%之间。系统进化树结果表明，7个代表株PCV3的Cap基因序列与12株参考株位于一个大的分支，另外1株单独构成一个分支(图3)，通过基因分析，8个代表株PCV3Cap基因序列未出现明显的遗传变异，只是几个碱基发生变化。

M.DNA 标准DL 2 000;1.空白对照；2～7:部分样品

图3 PCV3 Cap基因系统进化树

3 讨论

相关研究表明，2017年美国研究者从皮炎肾病综合征和患有繁殖障碍疾病的母猪中检测出PCV3，且皮炎肾病综合征的发病率越高，PCV3感染率越高，在患有繁殖疾病的母猪中及患有仔猪先天性震颤的仔猪中检测到唯一的病原体为PCV3，说明PCV3对猪的危害很严重[6-7]。许多相关研究表明，PCV3与临床中许多疾病产生的临床症状相关，可能对不同阶段的猪产生致病性[11-12]。因此，PCV3可能对养猪业存在潜在的威胁，应该引起重视。随着猪养殖数量的逐年增多，其PCV3阳性率也在增高，且在我国猪场中分布较广泛[13-14]。本试验2017年-2019年采集郑州地区规模化猪场中患病猪的1 175份样品中PCV3总阳性率为14.6%，呈现逐年升高的趋势，其中2019年阳性率最高(19.5%)，说明该地区猪场中的PCV3分布较广泛，且在流行。目前PCV3没有疫苗和有效药物和进行防治，尤其是规模化猪场中应该注重该病的净化与综合防控。

PCV3在郑州地区猪场中广泛流行，为了解该地区PCV3分子流行病学情况，选择8个代表株进行Cap基因检测与测序，分析其遗传变异情况。结果显示，8个代表株PCV3Cap基因序列与GenBank登录12株参考株的同源性在92.%～100%之间；7个代表株PCV3的Cap基因序列与12株参考株位于一个大的分支，另外1株单独构成一个分支，8个代表株PCV3Cap基因序个别几个碱基发生变化，未出现明显的遗传变异情况。说明该地区猪场流行的PCV3Cap基因序列未发生变异情况。PCV3Cap基因个别几个碱基发生变化是否与其致病性有关，有待进一步研究。郭影成等[14]研究表明，吉林地区PCV3Cap蛋白氨基酸发生变化。黄翠琴等[15]研究表明，2015年-2017年福建地区流行的PCV3Cap基因序列发生变化，且氨基酸序列替换。本研究结果与上述报道存在一定差异，可能与地区及PCV3遗传变异有关。本研究结果可为该地区猪场中PCV3流行病学调查及综合防控提供科学依据。