实验室水平单克隆抗体制备方法及相应纯化策略的研究进展

徐梦蔚，宋武琦 综述，付治美，张凤民 审校

哈尔滨医科大学微生物学教研室伍连德研究所黑龙江省免疫与感染重点实验室黑龙江省普通高校病原生物学重点实验室，黑龙江哈尔滨150081

抗体又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig），产生抗体是体液免疫系统的主要功能之一，抗体分子直径约为10 nm［1-2］。在胎盘哺乳动物中，抗体亚型包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，5种亚型抗体在生物学特性、功能及在体内分布位置（如IgE类抗体主要与肥大细胞和嗜碱细胞的细胞膜结合）均有所不同［3］，目前对IgG类抗体研究较多。天然的抗原分子刺激机体产生的抗体含有针对不同抗原表位的多种抗体，即多克隆抗体，其特异性较低。单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）是由单一B细胞产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，其克服了多克隆抗体特异性较低的缺点。mAb已广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞术等医学诊断技术；并可作为亲和层析中重要的配体用于蛋白质的提纯；也可与化疗药物或放疗物质连接，利用mAb的导向作用，直接杀伤靶细胞，用于肿瘤导向治疗。mAb的纯度是其产品重要的质量指标之一，不同方法制备的mAb需根据其物理化学属性（等电点、分子量、疏水性等）来选择不同的纯化步骤，去除不同的杂质，以满足实验需求。本文就实验室水平的mAb制备方法及去除制备过程中产生污染物相应纯化策略的研究进展作一综述。

1 实验室水平制备mAb的方法

广义上讲，mAb生产是指产生特异性抗体的整个过程，包括免疫原制备、免疫、杂交瘤生产、筛选和纯化过程；狭义上讲，mAb生产仅指mAb生产及纯化的步骤，不包括复杂的免疫原制备、筛选等步骤。随着mAb生产技术的发展，存在多种用于抗体生产的方法，本文仅对实验室水平的杂交瘤技术及基因工程技术2种mAb制备方法进行简介。

1.1杂交瘤技术 1975年，英国科学家Cesar Milstein和法国科学家George Kohler将鼠源的B淋巴细胞与肿瘤细胞融合形成杂交瘤细胞［4］，杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体生产及分泌功能，又具有肿瘤细胞的无限增殖功能。杂交瘤技术是通过采用特异性抗原免疫动物，获得能够分泌特异性mAb的B细胞，随后体外融合B细胞和骨髓瘤细胞，选择性培养和克隆化筛选出能够产生特异性mAb的杂交瘤细胞，并扩大培养，收集培养基上清进行纯化，从而获得抗体；或在动物体内注射杂交瘤细胞、收集动物体液（腹水、血清等）后进行纯化，从而获得抗体［5］。杂交瘤技术生产的mAb特异性较高，且易于大量生产，已成为基础生物学研究和临床医学必不可少的方法。尽管目前已有其他多种技术（如体外展示技术）用于mAb生产，但杂杂瘤技术仍是实验室水平制备mAb的首选方法，该方法也应用于针对新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）相关抗体的研究［6］。有研究表明，组合展示库可作为一种替代杂交瘤技术的mAb生产平台，但目前许多mAb最初仍是在小鼠或人源化小鼠中采用杂交瘤技术发现的［7］。

1.2基因工程技术 基因工程技术主要通过将质粒转染进宿主细胞使其分泌相应的mAb，该技术可在体外重组制备mAb，产生特异性极高的mAb，生产速度更快，使用该方法制备人源化mAb更便捷，可确保其临床应用的用量充足。目前，由于糖基化的需要，用于生产治疗性IgG类mAb的主要宿主是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、人胚胎肾细胞（HEK293）、骨髓瘤细胞（NS0）、人视网膜细胞（PERC6）［8］。有研究表明，基因工程技术通常在CHO及其他哺乳动物细胞系产生的早期阶段发挥作用，整合其他多种互补的方法有助于优化和推进单种方法无法实现的聚糖图谱［9］。

抗体片段为IgG经蛋白酶水解所形成的片段，是目前研究和临床中使用的新型抗体样分子，与mAb比较，其分子直径更小，但具有相似的高亲和力，更易穿透组织，发挥药效。酵母和细菌细胞是生产各种抗体片段的良好宿主，在各种细菌宿主中，E.coli是生产抗体片段和抗原结合片段（antigenbinding fragment，Fab）的主要菌种［10］。与哺乳动物细胞系统比较，E.coli系统用于生产抗体片段更加快速，且生产过程中不存在外源性物质（adventitious agents）污染的问题，避免了病毒去除及相应的验证步骤［11］。

mAb或抗体片段通常是从天然（杂交瘤技术）或重组体系（基因工程技术）中提取的，不同方法制备的mAb会产生不同的杂质，不同的分子纯度要求将影响样品处理和纯化步骤的选择，见表1。

表1 不同方法制备mAb或抗体片段的相关信息Tab.1 Data on mAb or antibody fragments prepared by various methods

2 实验室水平mAb的纯化步骤

体内研究通常需将mAb的纯度控制在95%以上，一些高剂量研究中，纯度需提高至99%，因此，mAb的纯化对于后续相关研究尤为重要。杂交瘤细胞系培养上清液的污染物主要由培养基成分组成，如生长因子、激素和转铁蛋白（transferrin，TRF）；腹水样品中可能含有宿主抗体、蛋白酶、核酸酶、核酸和病毒等污染物。上述两种样品均可能存在杂交瘤的其他分泌物（如细胞因子）和细菌污染，细菌还会分泌内毒素。基因工程方法收集的上清污染物主要来源于宿主，需要依据不同制备方法和采用不同培养基及其相应污染物来选择合适的纯化步骤。

2.1常规纯化 亲和层析法是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法，已广泛应用于mAb的分离和纯化，通常使用的层析介质均为天然蛋白［14］，主要包括天然蛋白A（Protein A）、天然蛋白G（Protein G）和天然蛋白L（Protein L）3种细菌蛋白，其抗体结合特性明确，如Protein L可与抗体轻链结合，常用来纯化一些抗体片段。CHEN等［15］对Protein L纯化方法进行了优化，提高了纯化效率，该方法在实验室水平上是可用的。Protein A和Protein G主要通过与Ig的Fc区相互作用，结合大多数哺乳动物的IgG，可用于多种抗体的分离纯化［16］。Protein A和Protein G与不同物种及不同Ig亚类的结合特性不同，Protein G的亲和力更广泛，是从大多数哺乳动物中分离Ig的首选方法［17］，如采用Protein G对人源IgG3的纯化效果更好。MENG等［18］通过Protein A一步纯化获取了抗Sema3FC-末端结构域的单克隆抗体（monoclonal antibody against the C-terminal domain of Sema3F，Sema3Fc mAb），该抗体纯度较高。目前，也有研究表明，Protein A和Protein G一步纯化法可用于双特异性抗体的研发［19］。

另外，Protein A／G也具有许多缺点［20］，如对宿主细胞蛋白、DNA和其他细胞来源杂质的非特异性结合；洗脱抗体需较低的pH（2.5~4.0），可能改变mAb的生物活性，导致mAb聚集及Protein A／G从色谱柱中漏出混入洗脱样品；费用高、载量低、线性流速有限等。目前，已有研究探寻新的mAb纯化方法，如ISHIHARA等［21］使用活性炭（activated carbon）代替Protein A亲和层析纯化mAb，单独使用活性炭纯化mAb的回收率低于Protein A，经进一步工艺优化后，mAb回收率有所提高；另有研究将短肽仿生亲和色谱作为一种新型抗体分离色谱，有望成为Protein A色谱的潜在替代品，经短肽仿生亲和色谱纯化获得mAb的纯度高达93%，回收率达84.7%［22］。但也有学者仍认为，Protein A具有较大的应用潜力，尝试通过改进柱体再生策略来延长Protein A树脂的寿命，提高其使用效率［23］。

Protein A／G一步纯化后抗体纯度可达85%以上，若有更高的纯度要求，需选择性添加预处理、精纯等步骤，纯化步骤的选择及操作顺序均将影响抗体的产量及纯度。NI等［24］采用Protein A亲和色谱一步纯化抗Plaa1 mAb，经SDS-PAGE分析表明，其抗体纯度完全能够满足实验室水平需求。KATEJA等［20］采用非Protein A纯化平台，即阳离子交换色谱（cation exchange chromatography，CEX）-多峰色谱（multimodal chromatography）-阴离子交换色谱（anionexchange chromatography，AEX）纯化了3种mAb，工艺收率达70%~80%，宿主蛋白残留<100 ppm，DNA残留<10 ppb，总聚集物含量<1%。

2.2预处理 杂交瘤细胞的培养基样品及基因工程转染后收集的细胞上清中均含有细胞、细胞碎片、脂质和凝结物质等大颗粒，会在随后的纯化中引起膜结垢（membrane fouling）现象，因此在常规纯化前采用离心法结合0.45μm过滤，获得适合层析的澄清液体，即收获的细胞培养液（harvested cell culture fluid，HCCF）。由于HCCF浓度可能不足，特别是采用低分泌细胞系生产mAb时，可通过超滤或透析法对样品进行浓缩。对预处理样品中大量白蛋白、TRF和其他大量可溶杂质，可使用硫酸铵沉淀法进行去除，随着硫酸铵浓度的增加，不同抗体在不同浓度时析出，从而去除可溶杂质。

脱盐是预处理步骤之一，不仅用于去除低分子量污染物（如盐），还用于不同色谱步骤前后缓冲液的交换及快速去除试剂以终止反应。可采用离子交换层析（ionexchange chromatography，IEX）或疏水层析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）进行盐析［25］。每增加一个步骤均会使mAb产量降低，且脱盐会稀释样品，因此仅在必要时进行脱盐步骤。对于亲和层析和离子交换层析，改变pH及离子强度较重要，必要时可进行脱盐，以降低溶液的离子强度。苯酚红（phenol red）是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，在纯化过程中可能结合至某些纯化介质上，应尽可能除去，可通过AEX去除。

2.3病毒的清除 病毒清除率通常以对数下降值（log reduction value，LRV）表示。在mAb纯化过程中可通过pH处理和热处理进行病毒灭活或清除，如辛酸能使包膜病毒完全失活［26］。另外，一些常见的层析步骤也有助于提高病毒清除率［27-28］，如阴离子交换色谱和多模式阴离子交换色谱介质的流穿步骤，病毒清除量可达4~5个LRV，疏水层析通常可获得相同数值的清除率；亲和层析和阳离子交换色谱也有助于去除病毒，清除量一般可达2~3个LRV［28-29］。

2.4多聚体的去除 mAb的聚集体会影响其生物活性、免疫原性及药代动力学，因此，单体纯度是mAb质量的关键指标之一，也是在临床前体内研究中作为候选药物的关键参数。当蛋白浓度较高或存在于低pH及高盐浓度条件下时，单体易聚集成双体或多聚体，这些聚集体能够显著降低mAb的生物活性［30-31］。分子排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）也称为凝胶过滤（gel filtration，GF），是在实验室水平上除去聚集体常用的手段，通常作为抗体纯化的最后一个步骤［32］。ZHANG等［33］比较了不同色谱类型树脂的多聚体去除能力，其中Capto MMCImpRes和Capto adhere可有效去除多聚体。

2.5核酸及内毒素的去除 内毒素是一类由脂质和多糖组成的大分子，来源于革兰阴性菌的外膜，可引起强烈的免疫反应，因此，限制mAb产品中内毒素的水平极为重要。核酸和内毒素常以聚体存在，经Protein A／G亲和纯化后，内毒素水平通常较高，较难以单一方法一次性去除，可根据其与抗体性质的多方面的差别，充分利用预处理、多聚体去除等步骤逐步去除，尽量避免额外加入专门用于去除核酸及内毒素的步骤。膜过滤／超滤是常用的去除核酸及内毒素的方法，速度快，通用性强，但只能去除与抗体分子量差异较大的核酸、内毒素分子。AIEX速度快、载量高，但某些电荷不外露的高聚体核酸及内毒素，无法结合阴离子交换柱，因此不能去除［34］。许多mAb属于碱性蛋白质，可在合适的pH下结合阳离子交换柱，使核酸和内毒素流穿，从而去除。内毒素、核酸在HIC的高盐条件下会凝集，上样时直接穿透，从而去除［35］。另外，目前市面上有部分内毒素亲和介质，其缺乏普适性，具有样品失活的风险，且价格昂贵，亲和介质的配体会脱落，需增添额外的步骤去除，影响mAb的产量，需慎重使用［36］。目前，mAb生产工艺一般在最后一步采用GF去除多聚体的同时，除去残留的核酸及内毒素。

2.6精纯 Protein A／G亲和层析一步纯化可获得纯度达85%~95%以上的mAb，但部分对纯度要求较高的mAb需进行进一步精纯。根据《中国药典》三部（2020版）［37］的要求，人用mAb除了需确保纯度外，还需验证使用的纯化方法有效去除污染物的同时保留目标产物，并能有效去除或灭活病毒。

对于更高程度的纯化或一步亲和纯化无合适配基的情况，必须使用包括捕获、中度纯化和精制（capture，intermediate purification，polishing，CIPP）在内的纯化策略，研发有效地多步精纯步骤（如离子交换色谱，疏水色谱和尺寸排阻色谱）去除抗体聚集体和片段，可提高单体纯度。对在缓冲液中易形成新聚集体的抗体，在精制过程中会形成新聚集体，这种情况需更换防止新聚集体形成的配方缓冲液。精纯步骤常用的方法包括AEX、CEX、HIC、羟基磷灰石层析（hydroxylapatite，HAP）和GF［17，38］，其中AEX和HIC采用流穿模式，CEX和HAP采用结合-洗脱模式，这些方法主要用于去除聚集体、宿主蛋白、宿主核酸及脱落的Protein A／G［11］。精纯一般采用两步层析以保持足够的纯化冗余，经典mAb精纯步骤采用流穿的AEX和结合-洗脱的CEX两步［39］，对具有基本等电点（isoelectric point，PI）的mAb，CEX甚至可作为初始捕获步骤［20］。但越来越多的公司开始采用一步精纯的工艺来提高收率和纯化速度，降低成本。如SINGH等［40］在Protein A层析后，使用了合成吸附杂交过滤器（synthetic adsorptive hybrid filter，AHF），改进了精纯过程相关的杂质去除和病毒清除步骤，实现了一步精纯。

3 小结与展望

多数实验室利用Protein A／G来捕获抗体，并利用至少1个IEX作为精纯步骤，仅少数工艺使用了HIC、HAP和GF等步骤，对于大多数实验来说，通过Protein A／G制得的mAb可满足基本实验需求。若需要进行体内实验，则需合理选择添加预处理、精纯等步骤，最终纯化策略的选择取决于特定的实验需求，根据纯化技术的主要优点和每个步骤开始或结束时样品的条件，选择纯化技术的合理组合。但每增加一个纯化步骤，抗体的收率就会随之降低，当抗体纯度达到较高水平时，伴随的是极低的回收率，此时可能需扩大实验室规模或进行工业化生产，以获得所需量的mAb。

目前，大量关于mAb的研究仍采用Protein A／G进行纯化，该方法是实验室水平纯化的金标准，但也有许多研究在Protein A／G纯化的基础上进行了优化，随着各种技术的发展，人们也在不断探索Protein A／G的替代方法，包括色谱及非色谱纯化，未来随着科学技术的进一步发展，mAb纯化步骤将会更简化，成本也会随之降低。