免疫原性细胞死亡及其在肿瘤治疗应用中的研究进展

杨颖综述，马雁冰审校

1.昆明医科大学 研究生院，云南 昆明650500；

2.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南昆明650000

近年，肿瘤免疫疗法已成为肿瘤研究和临床应用的热点，且发展迅速。免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）作为一种癌细胞特殊的死亡形式受到了较多关注，相关研究主要集中在探讨如何将诱导癌细胞发生ICD应用于抗肿瘤治疗中。ICD是细胞死亡的一种形式，通过释放肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）和肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen，TSA），暴露“危险信号”以刺激机体免疫系统产生免疫应答［1-2］，其特点是释放和／或增加表达损伤相关的分子模式（danger associated molecular patterns，DAMPs）、前体抗原炎性细胞因子和炎性介质［2］。主要的DAMPs包括三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）、钙网蛋白（calreticulin，CRT）、高迁移率族蛋白B1（high mobility group boxprotein B1，HMGB1）、热休克蛋白（heatshockprotein，HSP）、Ⅰ型干扰素（typeⅠinterferon，IFNⅠ）和膜联蛋白1（Annexin 1，ANXA1）等，继而激活和募集抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）后活化T细胞，产生针对肿瘤抗原的适应性免疫应答［3-4］，DAMPs与模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）结合引起一系列免疫事件。

目前肿瘤临床免疫治疗的挑战主要是，肿瘤细胞的低免疫原性、肿瘤抑制性免疫微环境的存在和肿瘤形成的一系列免疫逃逸机制使机体的免疫系统无法发挥正常的抗肿瘤作用。ICD由于其可产生免疫原性、可在肿瘤内免疫激活、可实现多重肿瘤抗原释放等特点，有望为抗肿瘤免疫治疗提供新的思路及策略。

1 ICD相关分子

1.1AT P ATP是细胞直接能源物质，但在ICD过程中，濒死的肿瘤细胞会释放ATP至细胞外，起到内源性危险信号的作用。有研究认为，自噬与ICD细胞释放高水平的ATP有关，但自噬促进ATP分泌的确切分子机制尚未明确［5］。ATP的释放涉及到细胞死亡前激活自噬、细胞凋亡、溶酶体胞吐作用等一系列复杂过程［6］。肿瘤细胞释放的胞外ATP作为一个“发现我”的信号，具有招募、激活APCs和炎性体通路的双重作用。释放至胞外的ATP与APCs（尤其是dendritic cells，DCs）上的P2X7与P2Y2嘌呤能受体结合，刺激其表型成熟和介导强大的趋化性［7］。胞外的ATP还会激活caspase-1依赖性NLRP3复合物炎症小体，引发白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的分泌［7］，产生的IL-1β可促使γδT细胞产生IL-17，作用于细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocytes，CTLs），从而产生IFNγ介导的抗肿瘤免疫反应［8］。另外，胞外ATP也会刺激DCs和巨噬细胞释放促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（tumour necrosisfactor-α，TNF-α）、IL-1β和IL-18，产生杀伤肿瘤细胞的活动［9］。1.2CRT CRT是一种高度保守的多功能钙结合蛋白，位于内质网（endoplasmic reticulum，ER）内，主要功能是蛋白质分子伴侣和维持Ca2+稳态。CRT在细胞膜表面发生凋亡前暴露，即在发生ICD的过程中CRT会从ER腔内向细胞膜表面转位，CRT暴露是ICD驱动抗癌免疫的关键因素之一［5，10］，细胞膜表面暴露的CRT（ecto-CRT）作为一个强有力的“吃掉我”信号，可增强APCs对死亡癌细胞的免疫原性识别和吞噬［11］。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是诱导ICD相关的CRT转位至细胞膜表面所必需的［5］，但两者相关的具体分子机制尚未明确。ERS涉及到蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）可磷酸化真核翻译起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）［12］，从而导致随后的信号传导事件，包括ER蛋白BAP31的caspase-8依赖性蛋白水解、促凋亡蛋白BAX活化、CRT从ER转运至高尔基体及含CRT囊泡的胞吐作用，最终导致SNARE介导的CRT在细胞表面的重新定位［12-13］。CRT与二硫键异构酶（ERp57）形成稳定的复合物，共转位至细胞膜，ERp57的丧失可导致表面CRT丧失而减少巨噬细胞的吞噬作用［14］。ecto-CRT可与APCs上的多个受体结合，包括CD91、血小板反应蛋白、补体成分1、q亚成分（C1q）受体和甘露糖结合凝集素［15］，其中，ecto-CRT主要被表达CD91的细胞识别、吞噬并结合，可触发一系列的免疫事件，以促进抗原呈递细胞（如DCs）的招募、抗原呈递、促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）的释放及17型辅助T细胞（Th17）的激活［16］。虽然ecto-CRT能引起一系列免疫反应，但其作用也会被体内的一些分子拮抗或抑制，如小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）介导的PERK下调，会抑制eIF2a的磷酸化及ER应激，从而阻止蒽环类药物诱导的CRT暴露。另外，抗吞噬的CD47作为一种“不要吃我信号”也会拮抗ecto-CRT的作用。当肿瘤细胞表面存在高水平的CRT时，CD47的表达量也会相应增加。因此，增加CRT的质膜暴露的同时阻断或拮抗CD47是一种诱导ICD，从而增强抗肿瘤治疗的策略。

1.3HM G B1 HMGB1是一种高度保守且广泛分布于哺乳动物细胞的核蛋白，在基因转录调节、稳定核小体和DNA修复等方面发挥作用。另外，HMGB1在炎性细胞分化、迁移和肿瘤转移过程中作为细胞外信号分子而发挥作用［17］；HMGB1还有促进DCs成熟、迁移、向T细胞呈递TAA及产生促炎细胞因子的功能［18］。肿瘤细胞在死亡后期分泌的HMGB1与多种PRRs结合，包括Toll样受体4（Toll-likereceptor 4，TLR4）及晚期糖基化终末产物受体（the receptor of advanced glycation end product，RAGE），从而激活DCs中的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK、p38和ERK1／2）和核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）［18］，促进免疫细胞释放IL-6和IL-10等细胞因子，进而参与炎性反应［19］；HMGB1可激活髓样分化主要反应基因88（major response genes of myeloid differentiation，MyD88）依赖性的信号转导通路，抑制吞噬体和溶酶体之间的融合，从而促进肿瘤抗原的加工递呈［20-21］；HMGB1还可抑制免疫抑制细胞Treg细胞的活性［20］。有研究证明，在慢性HBV感染中，HMGB1可通过RAGE-ERK和哺乳动物雷帕霉素靶标（mammalian target of rapamycin，mTOR）途径诱导外周Treg细胞的自噬［22］。HMGB1在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中显著上调，与患者的生存呈正相关。缺乏HMGB1的肿瘤细胞表现出诱导ICD和抗肿瘤免疫反应能力的受损。

1.4I F NⅠ IFNⅠ作为一组广谱抗病毒的细胞因子，具有抗病毒感染和免疫调节作用。IFNⅠ是在免疫应答启动阶段激活效应T淋巴细胞、NK细胞的关键细胞因子，可影响先天性和适应性免疫反应的进展，对微生物防御反应至关重要［7，23-24］。IFNⅠ可通过与Ⅰ型干扰素受体（typeⅠinterferon receptor，IFNAR）结合后的信号传导，诱导肿瘤细胞凋亡和抗血管生成，也可对免疫系统的细胞产生直接影响［25］。IFNⅠ直接抑制肿瘤和病毒感染细胞的增殖，并增加MHC-Ⅰ类表达，从而增强抗原识别，还可影响DCs的分化、成熟和迁移［26］。肿瘤细胞内固有IFNⅠ反应的激活已成为ICD的标志之一，产生IFNⅠ通过与肿瘤细胞上的IFNα和IFNβ受体结合，触发肿瘤细胞的自分泌和旁分泌回路，导致CXC-趋化因子配体10（cxc-chemokine ligand 10，CXCL10）的释放，发挥免疫刺激作用［27-28］。IFNⅠ的释放涉及多种机制，在化疗期间，由于细胞在死亡过程中RNA的释放，肿瘤细胞会发生内源性IFNⅠ反应［29］。DNA损伤剂也会在细胞质中通过dsDNA诱导IFNⅠ的产生［29］。YANG等［30］研究发现，IFNβ和顺铂的顺序组合比起单独给药治疗可更有效诱导eIF2α的磷酸化，参与对于CRT转位至关重要的ERS；其次，干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1）的上调有助于IFNβ和IFNβ-顺铂对eIF2α的磷酸化。另外，辐射诱导的IFNⅠ增强了DCs的交叉递呈［31］。

1.5H S P HSP家族作为热应激蛋白质，主要功能是协助蛋白质的折叠。HSP70和HSP90具有刺激肿瘤抗原摄取、DCs成熟等功能。HSP高表达是肿瘤细胞发生ICD的重要信号，CTLs在病毒感染和肿瘤形成过程中可对HSP-抗原肽进行识别，HSP70和HSP90可与抗原肽结合，并通过受体介导的HSP内吞作用将这些肽穿梭至APCs的抗原处理途径中，从而表达在Ⅰ类分子上［32］。HSP70和HSP90在ICD早期就携带肿瘤抗原肽暴露于细胞表面，晚期还会被动释放至肿瘤微环境中，通过结合DCs上的TLR和NK细胞上的NKG2A来介导癌细胞-免疫细胞的相互作用［15］。HSP-抗原肽递呈给CTLs可导致CTLs的激活，递呈给NK细胞则会导致抑制作用的丧失，CTLs与NK细胞的激活均发挥关键的肿瘤杀伤作用［32］。

2 诱导ICD在肿瘤治疗中的应用

2.1骨肉瘤 金涛等［33］采用可诱导人骨肉瘤细胞凋亡的辣椒素处理MG-63细胞，结果显示，CRT由ER转移至细胞膜表面、胞外ATP及HMGB1的释放增加。病毒为更好地复制繁殖，在感染复制等过程中的一系列机制也会诱导感染细胞发生ICD。MA等［34］在研究野生型腺病毒（adenovirus，Ad）血清型5、塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus，SFV）株SFV4和牛痘病毒（vaccinia virus，VV）Western Reserve株感染人骨肉瘤细胞株HOS的死亡途径和免疫激活时，发现3种病毒株均可诱导细胞外ATP的释放和HMGB1的增加。

2.2结直肠肿瘤 LIN等［35］研究发现，非热性的等离子体（nonthermal plasma，NTP）可诱导CT26小鼠结直肠肿瘤细胞表面CRT的暴露和ATP的分泌；在体外用NTP处理过的细胞作为疫苗免疫BALB／c小鼠，结果表明，可保护小鼠免受肿瘤的侵袭。TANAKA等［10］研究发现，在体外用光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）与糖结合二氢卟酚（G-chlorin）联合处理后的CT26细胞，可诱导CRT转位和HMGB1释放，随后，在CT26活细胞的试验中也得到了显著保护。植物多糖也有调节免疫和抑制肿瘤生长的功能，其中香菇多糖在处理人结直肠癌上皮细胞SW837后可诱导增加CRT、HSP70和HSP90的表达量［36］。另外，多种ICD诱导剂联合使用也是目前增强免疫原性的途径，JESSUP等［37］采用Ad和奥沙利铂（Oxaliplatin，OXA）混合注射CT-26肿瘤细胞后，可抑制肿瘤的生长；PHUNG等［38］采用纳米载体靶向小鼠结肠癌细胞MC-38共传递低剂量的阿霉素（Dox）和miRNA200c，通过CRT转位及HMGB1释放，增强了ICD，成功经miRNA200c诱导了小鼠体内PD-L1的有效下调，引发了明显的抗肿瘤效应。

2.3黑色素瘤 RODRÍGUEZ-SALAZAR等［39］采用新型免疫调节剂IMMUNEPOTENT CRP（ICRP）和OXA处理B16F10细胞后，衍生肿瘤来源的富含DAMP细胞裂解液免疫小鼠，发现ICRP+OXA治疗可防止黑色素瘤生长。邵晓雁等［40］在对恶性黑色素瘤维罗非尼耐药细胞株WM3248／vemurafenib的研究中证明，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）毒株FMW（NDV／FMW）可诱导WM 3248／vemurafenib细胞膜DAMPs增加，包括CRT、ATP、HMGB1和HSP90。BEK等［41］研究显示，在体外靶向黑色素瘤细胞的RNA受体视黄酸诱导基因-Ⅰ（RNAreceptor retinoic acid induciblegene-Ⅰ，RIG-Ⅰ）可导致黑色素瘤细胞发生ICD。铂类化疗药物可诱导ICD，但口服的化疗药物经消化代谢等过程后会降低疗效，OXA属于铂类，也存在该问题。CHOI等［42］将OXA与Nα-脱氧胆酰基-L-赖氨酰甲酯（Nα-deoxycholyl-L-llysyl methyl ester，DCK）络合为纳米乳液（OXA／DCK-NE）制备了一种口服制剂，发现在体内外实验中，OXA／DCK-NE均可有效诱导B16F10.OVA细胞中CRT和HMGB1的表达。因此，设计可引起ICD的化疗药物的复合配方和改进化疗药物的递送方式，有望增强诱导肿瘤细胞的ICD，达到更强的杀伤肿瘤作用。

2.4乳腺癌 HAN等［43］研究发现，缺氧以依赖ERS的方式不仅可增加人类和小鼠乳腺癌细胞系4TO7表面的CRT暴露，还可诱导其总表达水平上升，从而增强肿瘤细胞的ICD。基于金丝桃素的PDT可有效诱导小鼠乳腺癌4T1细胞发生ICD，引起CRT的暴露［44］。但PDT过程需要消耗大量的氧，肿瘤内部微环境持续缺氧引发了肿瘤免疫抑制，从而抑制PDT的疗效或使肿瘤免疫治疗失败。MAI等［45］以血小板膜（platelet membrane，PM）作为纳米载体，协同封装二甲双胍（Met）和IR780，制备了PM-IR780-Met NPs，并证明其可通过抑制线粒体呼吸而加强PDT的疗效，诱导了4T1细胞高水平的CRT和HMGB1表达。

2.5宫颈癌 刘剑英等［46］实验采用不同电场强度的高压纳秒脉冲电场（nanosecond pulse electric fields，nsPEFs）作用于HeLa细胞和U14细胞，结果发现，在场强达到一定阈值及作用时间延长到一定时间后，CRT、HSP和HMGB1的表达均有所升高，从而诱导其发生ICD。

3 小结与展望

手术、放疗、化疗等的联合使用在一定程度上延长了恶性肿瘤患者的生存期，但肿瘤治疗目前在医学上仍是一大难题。探究如何利用肿瘤细胞死亡和宿主自身的免疫系统相结合清除肿瘤细胞是一条可行且有效的治疗策略。ICD作为一种可引起免疫反应的细胞死亡，有望打破免疫抑制的肿瘤微环境，启动T细胞介导的适应性免疫应答，动员全身的免疫反应，从而实现长期抑制肿瘤的作用。作为抗肿瘤免疫治疗的重要组成部分，进一步研究并阐明ICD发生的相关机制对肿瘤治疗，甚至肿瘤疫苗的研制尤为重要。

治疗性肿瘤疫苗通过机体的免疫系统识别肿瘤抗原来特异性的杀伤肿瘤细胞，在理论上是具有广泛前景的免疫治疗策略。但由于肿瘤复杂多变的免疫抑制环境、遗传机制及一系列免疫逃逸机制使肿瘤疫苗在实际临床应用中缺乏显著疗效。肿瘤细胞发生ICD时释放的DAMPs能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并提供丰富的肿瘤抗原，这为肿瘤疫苗研究指引了新方向。将诱导了ICD的死亡及濒临死亡的癌细胞或ICD来源的肿瘤细胞裂解物（tumor cell lysate，TCL）作为肿瘤抗原刺激免疫系统产生应答，在恶性肿瘤治疗方面应用前景广阔。ICD能够将死亡的癌细胞转化为一种“疫苗”，在不添加任何佐剂的情况下能够诱导抗癌免疫［20］。另外，物理细胞死亡模式，如PDT或热疗法（heat treatment，HT）等能够引起ICD，从而产生原位疫苗效应，诱导抗肿瘤免疫［47］。综上所述，经ICD诱导剂（化疗药物、放射、PDT和传染性病原体等）诱导的肿瘤细胞具有成为新型肿瘤疫苗的巨大潜力。

目前，放化疗是临床重要的治疗手段，单一的化疗药物与放疗即使诱导了ICD，也难以达到更理想的杀肿瘤效应，要充分诱导肿瘤细胞发生ICD，在临床上需高剂量的化疗药物，由于严重毒副作用难以实现。多种ICD诱导方式或药物的结合可能在提高ICD的诱导效率及其免疫效应，激活不同信号通路、减少产生耐药性的同时还可改善安全性。另外，化疗药物可能无法到达肿瘤组织发挥作用，机体免疫能力低下可能造成ICD诱导不足，从而使临床疗效一般，因此，亟需探索更高效精准的ICD诱导药物、递送载体或系统及可辅助增强ICD作用的药物，如RT53和肿瘤治疗电场（TTField）［48-49］。另外，在动物研究中探索的最佳条件不一定适合临床，如不同的ICD诱导方式、剂量可能会对不同肿瘤细胞产生不同的效应，且单一诱导ICD，还不足以解决肿瘤治疗的难题，基于ICD诱导的多种免疫疗法联合使用可能是未来肿瘤免疫治疗的新方向，如联合免疫检查点疗法。今后，将对高效诱导肿瘤细胞发生ICD及其作用机制进行进一步深入研究，以期为合理利用ICD诱导进行肿瘤治疗及设计更有效的肿瘤疫苗进行临床应用提供理论依据。