NLRP3炎症小体在嗜中性粒细胞哮喘中的作用

叶倩 陈志敏

哮喘被认为是Th失衡，导致IgE大量分泌，肥大细胞及嗜酸粒细胞致敏，再次接触过敏原后，相关细胞分泌致敏物质致使气道高反应[1]。临床特征表现为间歇性哮鸣、胸闷、咳嗽、呼吸急促[2]。发作时间多为夜间及凌晨，多数可自行缓解或药物治疗后缓解。哮喘发病率逐年上升，全球有超过3亿哮喘患者，中国约有3 000万患者[3]。大部分哮喘患儿对过敏原有敏感性及特异反应性，且对糖皮质激素敏感[4]。部分哮喘患儿临床表现为对激素不敏感，故将其称为非过敏性哮喘。该类哮喘患儿支气管壁或痰液中中性粒细胞百分比≥71%，又称嗜中性粒细胞哮喘[5]，相关调节机制目前仍在研究中。中性粒细胞增多主要原因包括相关趋化因子（如IL、白三烯和TNF）表达增加、中性粒细胞呈抗凋亡性及巨噬细胞对其清除受限[6]。而气道中的中性粒细胞浸润可加重气道梗阻，使得肺功能恶化，重症哮喘比例增加及治疗难度加大[7]。研究指出支气管壁或痰液中的中性粒细胞数量与哮喘的严重程度呈正相关[8]。嗜中性粒细胞哮喘除了有中性粒细胞浸润和激素难治性特点外，气道病原微生物定植也是其特征之一，目前已经检测到的病原微生物包括肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和金黄色葡萄球菌[9]。气道总细菌负荷与痰液中中性粒细胞百分比呈正相关，与嗜酸性粒细胞百分比呈负相关，故气道微生态紊乱是嗜中性粒细胞哮喘的关键特征，临床上表现为肺功能下降、哮喘临床症状加重及对激素治疗不敏感[10]。

炎症小体是一种包浆蛋白复合物，可以识别各种外源性微生物和内源性感染信号，并通过炎症因子来启动炎症反应。典型炎症小体主要有模式识别受体、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck,ASC）和效应蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1）等组成。在已知的炎症小体中核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptors,NLRs）家族一直备受关注[11]。其中NLRs亚家族的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain-containing 3,NLRP3）炎症小体最具有特征，该炎症小体以复合体中的NLRP3蛋白命名[12]。本文就NLRP3炎症小体在嗜中性粒细胞哮喘中的作用及其机制研究作一综述，并对未来哮喘靶向治疗提出展望。

1 NLRP3炎症小体的简介和功能

NLRP3蛋白作为一种分子量为115 kDa的包浆蛋白，由骨髓来源的巨噬细胞在微生物和非微生物如细菌毒素、颗粒物和脂多糖的刺激下产生，在单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、成骨细胞和上皮细胞中表达[13]。包含3个结构域：起到信号感应的C端富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat,LRR）、调控蛋白质寡聚化的中心ATP酶三聚体结构域（central nucleotide-binding and oligomerization,NACHT）及与超分子复合物形成有关的N端Pyrin结构域（Pyrin domain,PYD）[14]。LRR结构域被认为负责调节NLRP3蛋白的活性。NACHT因具有ATP酶活性，故而与NLRP3蛋白自我结合及发挥功能有关。NLRP3炎症小体信号传导通路主要是通过LRR结构域进行感知，之后NLRP3蛋白通过NACHT进行寡聚化，然后PYD合成ASC蛋白，激活效应蛋白Caspase-1，经Toll样受体（toll-like receptors,TLRs）的信号传导，通过磷酸化-去磷酸化和去泛素化的方法转录，从而对炎症反应产生效应[14]。

NLRP3炎症小体激活机制仍在研究中，其激活过程分为两步：第一步，启动由炎症刺激提供，使得TLRs、NLRs或细胞因子暴露，从而诱导活化NF-κB，最终上调NLRP3蛋白和IL-1β的表达[15]。第二步，激活步骤则是由感染、组织损伤或代谢失衡期间出现的刺激物触发，例如毒素、晶体物质及入侵病原体等，通过NLPR3炎症小体结构重组，促进IL-1β和IL-18分泌，导致细胞及组织的炎症性坏死[16]。已有文献指出钾离子外流、钙离子信号传导、钠离子内流、氯离子外排、线粒体功能障碍及活性氧产生均参与了NLRP3炎症小体的激活[17]。

目前已发现代谢紊乱、动脉粥样硬化、中枢神经系统疾病及炎症性疾病等慢性和退行性疾病与NLRP3炎症小体异常激活有关。当NLRP3炎症小体受到ATP、毒素、RNA病毒等刺激，可产生大量的IL-18及IL-1β[18]。IL-1β主要由先天性免疫细胞如巨噬细胞和树突状细胞产生，T细胞增殖刺激IL-1β激活，触发局部黏膜免疫反应，可将中性粒细胞直接引导到损伤或感染部位。IL-18具有免疫调节作用，IL-1β和IL-18过度产生会导致无菌性炎症发生，从而加重患儿发生自身免疫性疾病的风险[19]。由于NLRP3炎症小体在自身免疫性疾病中的病理生理作用，现被认定为许多免疫性疾病治疗的有效靶点。

2 嗜中性粒细胞哮喘的发病机制

嗜中性粒细胞哮喘中的关键免疫细胞Th17亚群[20]，通过分泌 IL-17A、IL-17F、IL-22，在支气管组织[21]和支气管肺泡灌洗液[22]中发生作用。IL-17A是调节机体中性粒细胞分泌、聚集及起效的重要细胞因子，可致使气道高反应、激素抵抗、杯状细胞分泌增多、气道纤维化和气道重塑等[23]。IL-17F和IL-22可诱导支气管上皮分泌黏液，刺激趋化因子受体和IL-8产生，使得肺部中性粒细胞分泌增多[24]。此外，Th1细胞参与嗜中性粒细胞哮喘也早有报道[25]，肺泡灌洗液中Th1细胞数量与肺功能恶化程度相关[26]。在抗原刺激下，细胞因子IL-12和IFN-γ分泌，致使Th0细胞向Th1细胞分化，Th1细胞激活中性粒细胞表面的趋化因子，该趋化因子再反作用Th1细胞，往复循环[27]。再者，中性粒细胞可介导先天性免疫应答反应及损伤相关的分子模式信号，上调金属蛋白酶、中性粒细胞弹性酶及多种细胞因子分泌，促进免疫反应[28]。其中金属蛋白酶可导致气道结构损伤，促进气道上皮细胞持续募集中性粒细胞，造成炎症的反复，导致患者的气流受限及气道重构[29]。中性粒细胞弹性酶可直接降解组织蛋白，调控炎症反应。

3 NLRP3炎症小体与嗜中性粒细胞哮喘关系的基础及临床研究

嗜中性粒细胞哮喘患者痰液中NLRP3炎症小体的基因表达增高，使用特异性抑制剂或敲除NLPR3基因，可使得气道高反应增强及气道炎症减轻[30]，表明了NLRP3炎症小体在嗜中性粒细胞哮喘的发病机制中起了关键作用[31]。

3.1 动物实验 Xu等[32]采用腹腔注射卵白蛋白方法建立中性粒细胞哮喘小鼠模型，应用NLRP3基因抑制剂治疗后，体内IL-1β及IL-18水平明显下降，肺内浸润细胞、分泌的黏液以及肺泡灌洗液中的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量均下调，哮喘气道免疫反应得到抑制。另一项研究采用甲苯二异氰酸酯诱导建立以中性粒细胞浸润的哮喘模型，其中抑制组采用效应蛋白Caspase-1抑制剂，该组小鼠气道的中性粒细胞数量减少，气道高反应及气道重塑得到改善，间接表明了NLRP3炎症小体可通过效应蛋白Caspase-1参与哮喘的炎症反应；研究还发现抑制组小鼠IL-1β和IL-18水平下降，间接证明了IL-1β和IL-18可能也与NLRP3炎症小体的效应蛋白Caspase-1活性有关[33]。IL-1β作为一种由Caspase-1产生的强效炎症细胞因子，与包括哮喘在内的许多慢性炎症性疾病有关，可在疾病早期损害气道上皮屏障功能[34]。嗜中性粒细胞哮喘患儿IL-1β mRNA表达量显著升高，表明了IL-1β在嗜中性粒细胞哮喘中发挥关键作用[35]。此外，IL-1β和IL-18诱导CD4+效应T细胞产生IL-17。IL-17可对中性粒细胞产生强大的趋化作用，通过旁分泌及自分泌途径增加气道黏蛋白的表达，加重气道炎症，引发气道重构，与患儿的哮喘严重程度呈正相关[36]。综上，NLRP3炎症小体激活了IL-1β/IL-17炎症轴，调节杯状细胞，增加气道黏蛋白分泌，破坏气道上皮屏障功能。

3.2 临床研究 一项含有实验组85例哮喘患者（分为嗜中性粒细胞组、嗜酸性粒细胞组及少粒细胞组）和对照组27名健康者的临床研究，通过对参与者进行临床评估、肺功能测定及痰液诱导，将痰液进行细胞计数、基因表达和蛋白介导，从而检测NLRP3炎症小体的表达，结果发现嗜中性粒细胞组NLRP3炎症小体基因表达、促炎Caspase-1基因及IL-1β水平表达较嗜酸性粒细胞组和少粒细胞组高，说明NLRP3炎症小体在嗜中性粒细胞哮喘中优势表达，并可通过调节IL-1β对炎症反应产生作用[35]。激活的NLRP3炎症小体通过Caspase-1蛋白酶诱导巨噬细胞分泌IL-1β，造成哮喘患者气道炎症的发生，临床表现为出现重症哮喘及类固醇抵抗型哮喘概率增高[37]。Rossios等[38]还发现NLRP3炎症小体及其激活后产物IL-1β、IL-18的表达与痰液中中性粒细胞百分比显著相关，但与嗜酸性粒细胞百分比无关，嗜中性粒细胞哮喘患者组临床症状最为明显，肺功能较差，常规口服类固醇药物比例最高。而抑制NLRP3炎症小体可减少IL-1β、Th2类细胞因子、中性粒细胞相关细胞因子分泌，减少气道上皮细胞中性粒细胞数，最终减轻气道高反应[39]。Kim等[40]通过监测临床参与者痰液中的中性粒细胞数量、吸入激素剂量及用力呼气容积与NLRP3炎症小体水平的关系，证明了NLRP3炎症小体可参与哮喘的控制，与疾病严重程度相关，可能为后期治疗的靶点。

3.3 靶向治疗 目前传统的哮喘治疗方法是吸入激素、使用长效β2受体激动剂、口服白三烯调节剂、使用茶碱类药物及脱敏治疗等。靶向治疗是近年来提出的新观点，在嗜中性粒细胞哮喘病程发生、发展的传导通路上进行干预，减少中性粒细胞气道浸润，降低气道高反应，从而对疾病进行控制。MCC950作为NLRP3炎症小体强有力的抑制剂，目前已有研究指出低剂量的MCC950可有效抑制嗜中性粒细胞哮喘患者的气道炎症，并使得其气道白细胞数量下降及气道高反应减轻，可达到类似类固醇治疗的疗效[40]。此外，Caspase-1抑制剂通过阻断Caspase-1上调从而抑制NLRP3炎症小体的激活，最终减轻气道炎症[39]。NLRP3炎症小体可作为除类固醇药物、白三烯受体拮抗剂、β2受体激动剂以外的新的治疗靶点，避免了激素不敏感哮喘急性发作后及后期控制欠佳需大量且长期使用类固醇药物后出现钙磷及骨骼代谢异常的不良反应，以期达到哮喘的分子靶向治疗。

4 NLRP3炎症小体未来研究方向

目前大量基础及临床研究限制于样本量不够及局限性对照性研究。未来笔者认为可收集一定量的嗜中性粒细胞哮喘临床病例，进行NLRP3炎症小体与白三烯受体拮抗剂、β2受体激动剂治疗的对比性研究，以发现NLRP3炎症小体的分子靶向治疗优势。同时通过前瞻性研究，对NLRP3炎症小体分泌的细胞因子、蛋白酶进行定量及定性研究，观察其与嗜中性粒细胞哮喘疾病进展及预后的关系。

5 结语

综上所述，嗜中性粒细胞哮喘作为哮喘中激素不敏感及治疗反应欠佳的一种类型，可出现中性粒细胞浸润气道上皮的现象。目前临床上仍致力于其生物标志物及气道微生物群的研究。NLRP3炎症小体作为近年研究新热点，国内外已有多项研究证实了其对嗜中性粒细胞哮喘疾病发生、发展的作用。但大部分研究仍停留于动物实验，未来可开展多中心、大样本、可重复的基础与临床研究，从而为嗜中性粒细胞哮喘个性化治疗提供有力的循证依据。