超声响应下载药纳米材料在肿瘤靶向治疗中应用研究进展

朱江 王敏言

近年来，使用非侵入性手段刺激特定刺激响应纳米材料来辅助肿瘤靶向治疗已经成为了一个重要的研究领域。常用的非侵入性物理刺激有4种类型：超声波、光、电场和磁场。刺激响应纳米材料可以用于辅助药物递送、癌症治疗和组织工程。非侵入性物理刺激和刺激响应纳米材料的结合可以增加药物在靶组织积累及释放的可控性，降低药物的非特异毒性，提高药物的传递效率，带来更好的治疗效果。笔者将专注于超声波控制药物释放在癌症治疗中的作用，就超声波作为刺激源的原理、超声波对材料的影响，以及如何与纳米材料协同作用作一述评。

1 超声波的定义与发展历史

1.1 超声波的定义 声波是由物体振动产生的一种机械波，每秒的振动次数称为频率，人耳可闻及的频率范围为16～20 kHz。超过人耳听觉阈值即频率＞20 kHz的声波为超声波，简称超声[1]。

1.2 超声波的发展历史 19世纪40年代，维也纳大学的神经学专家Dussik等[2]通过超声波透过颅骨诊断脑损伤和定位脑室后，超声波开始应用于医学诊断。而早在超声波用于医学诊断之前，就发现其具有治疗能力。1927年Wood等[3]描述了超声波治疗后组织的持久变化。20世纪40年代，美国哥伦比亚大学的Lynn等[4]提出用超声波加热治疗的建议。到20世纪70年代末，超声波的热效应广泛应用于癌症的靶向治疗。高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound,HIFU）治疗肿瘤的主要机制，即超声波的热效应，近20年来HIFU已经成为了传统肿瘤治疗的替代方案之一。

2 超声生物学效应

超声生物学效应是超声波治疗的基础。超声波作用于人体会产生一系列生物学效应，主要包括热效应和非热效应，其中非热效应又包括空化效应和超声辐射力。

2.1 热效应 每当超声波传播到诸如组织之类的物质中时，波的幅度会随着距离的增加而减小，这种衰减是由于吸收或散射造成的。吸收是一种机械能转化为热能的一种机制，散射被认为是改变波传播方向的机制。因为介质可以吸收能量来产生热量，所以只要产生热量的速度大于热量排出的速度，温度就会升高[5-7]。一定强度的超声波在人体内传播时，超声波的能量被组织吸收，较高的能量沉积（＞55℃）会引起组织细胞内的蛋白质凝固、变性和坏死，这是HIFU治疗的主要工作原理，较低的能量沉积（＜55℃）可以诱导细胞通透性增加，从而加强纳米级别的物质进入细胞，加强超声激发疗法的疗效[8]。

2.2 非热效应

2.2.1 空化效应 空化效应是指在超声波作用下，液态介质中的微小气泡被激活后，产生震荡、膨胀、收缩以及内爆等一系列复杂的动力学过程，这被认为是促进药物靶向输送的主要机制[9-10]。空化效应可以分为惯性空化和稳定空化。

惯性空化是当微气泡在声学循环的一部分期间膨胀，然后由于不规则振荡和空腔的快速增长而迅速塌陷的过程，这导致微气泡碎裂成多个更小的微泡。在微气泡崩塌期间，流体中会产生冲击波，形成微射流。有研究证明，冲击波和微射流会产生非常大的力，可以穿透细胞膜，甚至渗透血管[11-12]。冲击波、微射流及随后的声孔效应都可以诱导细胞摄取小分子和高分子量的药物。稳定空化是指微气泡在低声压下对称性压缩和膨胀，气泡直径保持相对恒定而不破裂，这种稳定的振荡会在微气泡周围产生液体流，即“微流束”[13]。当这些振动的微气泡靠近细胞时，会对这些细胞产生剪切应力。剪切应力水平在很大程度上取决于超声波参数，其参数范围一般在100～1 000 Pa[14]。这些稳定的振荡也可能促进大分子药物和纳米颗粒的细胞内输送。Forbes等[15-16]研究发现，在低于惯性空化阈值强度的声波暴露下，细胞可摄取异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐，相比之下，稳定空化微泡需要与细胞直接接触才能影响细胞膜，惯性空化微泡的影响范围更大。

2.2.2 超声辐射力 超声波对位于其传播路径上的吸收或反射体会产生一种具有单一方向的作用力，这就是超声辐射力[17-18]。超声辐射力可分为主辐射力和次辐射力。前者能改善药物和基因载体沿波传播方向向血管外渗漏，后者效应会增加单个气泡之间的振荡、相互吸引和聚集。脉冲HIFU产生的辐射力可以选择性地促进脂质体阿霉素（doxorubicin,DOX）[19]、对比剂[20]和裸DNA[21]的传递。

3 超声激发载药纳米粒在肿瘤靶向治疗中的应用

3.1 靶向传递化疗药物 20世纪80年代，熊本大学医学院的Matsumura等[22]发现肿瘤血管对大分子化合物具有高度的渗透性，这些大分子化合物进入肿瘤组织后，会在肿瘤组织内滞留较长时间，他们用“增强通透性和保留效应”（enhanced permeability and retention effect,EPR effect）这一术语来描述实体瘤血管系统的独特病理生理现象。EPR effect是化疗药物被动靶向的基础，而超声波可以作为一种相对无害的非侵入性刺激，以增强癌症化疗药物的作用，而且可以在特定部位实现。

当超声与化疗药物联合使用时，能加强被动靶向作用。早在1982年，Hahn[23]试图确定热效应是否会影响博来霉素对小鼠的辐射诱导纤维肉瘤（radiationinduced fibrosarcoma,RIF）的疗效。他们通过水浴加热、射频辐射和超声波热疗诱导3种方法来实现热疗，结果表明通过超声波热疗诱导的治愈率最高。2002年，Feril等[24]回顾了超声波在增强抗肿瘤药物疗效方面的应用，并回顾了一系列研究，这些研究报道了在升温不明显的情况下增强抗肿瘤药物效应。他们提出了一些可能的机制：（1）超声波诱导细胞膜通透性增加；（2）超声波诱导靶细胞对相关药物的敏感性增加；（3）超声波诱导药物修饰；（4）超声波或药物单独引起的局部损伤，这些机制综合作用下导致细胞死亡。

为了进一步增强化疗药物的靶向作用，超声波控制的药物递送平台不断被开发。Dromi等[25]利用脉冲高强度聚焦超声（pulsed high-intensity focused ultrasound,p-HIFU）的热效应联合热敏脂质体，在小鼠上实现DOX静脉注射后于肿瘤处局部释放，与单独给药或非热敏脂质体载药相比，p-HIFU联合热敏脂质体载药有效利用了脂质体和热疗的双重优势，显著增加DOX传递的效率，降低肿瘤生长速率。Rapoport等[26]通过将全氟戊烷与聚合物胶束包裹在一起，制备了负载DOX的声敏（相变）纳米颗粒，结果发现在生理温度下，液体纳米液滴转化为微米级气体；DOX稳定地保留在微泡中，但在超声波照射下释放；同时，微泡的空化效应增加了肿瘤细胞的药物摄取。

微泡最初被设计用于辅助超声诊断，但超声的空化效应为其提供了许多可能性。大多数微泡的直径约为2～8 μm，因此可以在整个血管系统中自由循环。微泡制剂一般由蛋白质、脂质或聚合物组成的外壳，由空气、六氟化硫（sulfur hexafluoride,SF6）或更常见的氟化碳气体内核组成。部分微泡使用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）等试剂进一步稳定脂质壳，这也有助于逃避网状内皮系统（reticuloendothelial system,RES）的吞噬，从而延长在血液中循环时间[27]。作为超声响应纳米级材料，由于其物理特性，基于微泡的药物可以实现超声实时监控下的肿瘤治疗。这样非侵入性实时监测的方法能应对不同肿瘤结构或手术治疗禁忌等情况提出的挑战。为了增强微泡在靶组织的有效积累，有研究进一步开发了基于微泡分子水平的靶向药物递送系统。Wu等[28]研究证实，A10-3.2靶向前列腺特异性膜抗原的适配体偶联的纳米泡（nanometer bubbles,NBs）形成前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen,PSMA）特异性的靶向超声对比剂，对人前列腺癌荷瘤裸鼠模型中过度表达的PSMA存在特异性。

超声波控制的药物递送平台达到提高局部药物或基因的浓度、使药物避免被肝脏摄取、延缓药物释放、减少给药次数、减小给药剂量、增加药物疗效和减轻全身不良反应的目的。

3.2 靶向传递基因 基因治疗是将正常基因导入靶区域组织细胞来纠正或补偿异常或缺陷基因，以达到治疗疾病的目的[29]。在上述方法中，超声结合微泡、脂质体等超声响应纳米粒可以为非侵入性控制药物在体内特定靶点沉积提供基础。基因治疗成功的关键在于：（1）治疗性核酸必须有效地输送到所需的作用部位；（2）治疗性核酸到靶部位后，必须通过细胞膜运输入该部位的靶细胞。本质上，这些挑战与以上提到增强癌症化疗药物作用的超声波控制药物递送平台类似。迄今为止，大多数基因治疗采用方法是使用基于病毒的载体系统来实现治疗性核酸向靶细胞的递送，因为病毒提供了进入细胞内空间的理想方法。然而，临床实践发现，病毒载体系统可能对患者造成严重不利影响，其中包括引发不良免疫反应以及与癌基因启动子/基因附近的序列整合相关的挑战[30-31]。

超声介导的基因传递是治疗癌症的一个极具吸引力的选择，微泡和脂质体都能作为超声介导基因传递的有效载体。微泡被设计成直接将DNA结合在其外壳上或在其核心包含遗传物质。在这样的系统中，微泡既是空化核又是血管内基因载体系统。

Wu等[32]使用siRNA与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）结合的靶向纳米泡联合低频超声靶向微泡破坏（ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD）有效转染肝细胞癌细胞（hepatocellular carcinoma,HCC）。结果表明，这些纳米泡有良好的靶向HCC的能力，并且显著提高了HCC中神经上皮细胞转化基因1（neuroepithelial cell transforming gene 1,NET-1）的沉默。

也有报道称，由于DNA和RNA的磷酸骨架为负电性，阳离子微泡（cationic microbubbles,CMBs）可以增强DNA的承载能力。Kopechek等[33]将带有信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）诱饵的阳离子脂质用微泡包裹输送到鳞状细胞癌中，在超声波辐射下，STAT3信号在体外和体内均受到抑制，显著抑制肿瘤生长，降低下游靶基因表达。Xu等[34]联合UTMD和脂质体转染短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA），明显抑制MCF-7细胞系中异黏蛋白（metadherin,MTDH）的表达，从而降低细胞活力，减少细胞迁移、侵袭和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），进一步证明了超声波可以非侵入性地促进体内基因转移以及微泡的存在显著影响了基因表达。

总之，超声波介导下的基因传递在基因疗法治疗癌症方面具有巨大的潜力。超声波可以在基因表达或抑制方面提供一种时间、空间特异性的外部刺激，可作为单独治疗手段，也可以基于化疗，提供进一步的个体化治疗。

3.3 声动力疗法（sonodynamic therapy,SDT） SDT这个术语源于光动力疗法。然而，与光动力疗法光敏剂直接由光激发产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）不同，SDT是通过超声波诱导的空化和声敏剂介导产生自由基，杀死附近快速分裂的癌细胞。可见光在组织中衰减迅速，穿透性有限，只能在表面或术中使用，但声波可以到达组织深部，更具应用潜力，但是SDT的机制仍未明确。目前最有说服力的解释是：ROS是由超声波引起的空化效应产生，其次是声致发光和热解。在超声波的辐射下，气泡会成核、生长、爆炸，也就是空化效应，气泡爆炸中产生的能量会产生光，产生“空穴-电子”对，继而产生ROS或激活声敏剂，通过系统间交叉（intersystem crossing,ISC）产生ROS[35]。空化效应能产生巨大的能量，但是能量在局部释放和冷却速度快，在临近组织中的不良反应很小。这个过程中，声敏剂可能被分解成自由基，显著增强治疗效果，它们被认为是SDT的重要组成部分。在过去的几十年中已经开发不同类型的声敏剂有：有机分子[36-39]、无机纳米材料[40-41]、杂化物[42]和金属基系统[43-44]等。大多数声敏剂都有疏水性，容易在生理环境中发生聚集，从而影响其药代动力学特性。借助纳米技术，使用声敏剂联合超声可以有力克服这些限制。封装的纳米粒子可以作为声敏剂，提高SDT效率。此外纳米粒子通过降低空化阈值，为空化泡的产生提供了更多的成核位点。卟啉类似物如4-甲基苯基卟啉（tetraphenylporphyrin,TTP）、血卟啉单甲醚（hematoporphyrinmonomethyl ether,HMME）和原卟啉Ⅸ（protoporphyrin IX,PpⅨ），在SDT中获得了较多的关注，例如Ma等[36]使用猛（manganese,Mn）、锌（zinc,Zn）、二氧化钛（titanium dioxide,TiO2）3种金属及金属氧化物合成了金属卟啉配合物：Mn-TTP、Zn-TTP和TiO2-TTP，并使用人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）包被配合物，可以在11 cm的深层组织中表现出优异的超声激活能力。除此之外，无机纳米声敏剂在体外超声诱导SDT效应方面也具有较高的稳定性，其中基于TiO2半导体纳米声纳传感器已在癌症治疗中得到探索。Deepagan等[45]开发了亲水性Au-TiO2纳米复合材料（HAu-TiO2NCs）作为改进SDT的声敏剂。他们研究了HAu-TiO2纳米碳素的物理化学性质，并与未沉积金的纳米碳素进行了比较。HAu-TiO2NCs经超声照射后产生大量ROS，在体内系统给药后可完全抑制肿瘤生长。这些研究结果提示，声动力疗法可能在未来给癌症的靶向治疗提供一个替代方案。

综上所述，超声波激发的药物递送平台在临床药物递送治疗和提高治疗效果方面有独特的应用前景。本文描述了超声激发载药纳米粒在肿瘤治疗中的各种应用策略，但尽管超声激发疗法已经取得很大进展，但在临床实践中仍有许多困难需要解决，例如介质作为外来物质，容易引起体内免疫反应，其次介质的靶向性需要进一步增强，另外介质在体内的药代动力学也需要被研究者们研究。希望这些问题能够随着未来超声激发疗法的进一步研究而得到解决。