miR-433在子痫前期患者中的表达及对滋养层细胞迁移和侵袭的影响研究

张月霞，李 翔，张永苗，董 莉

1.南京市中西医结合医院妇产科，江苏南京 210014；2.南京市中医院检验科，江苏南京 210022；3.南京市中西医结合医院检验科，江苏南京 210014

子痫前期(PE)是一种妊娠并发症，是造成胎儿和产妇死亡的主要原因[1]。全球有3%～8%的妊娠期女性受到PE的影响[2-3]。PE主要表现为在妊娠中期或晚期、分娩过程中或分娩后出现的产妇高血压、蛋白尿、血小板减少等症状，危及产妇和胎儿的生命。滋养层细胞的异常增殖和迁移侵袭会促进胎盘释放可溶性因子从而导致PE的发生[4]。研究发现，微小RNA在滋养层细胞中的异常表达可影响PE的进展[5-7]。微小RNA-433(miR-433)与多种肿瘤细胞的扩散、迁移侵袭有关[8-9]。然而，目前鲜见miR-433对PE患者滋养层细胞的影响研究。因此，本研究旨在探讨miR-433在PE患者中的表达及其影响机制，为PE患者的治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集于2018年3月至2019年12月南京市中西医结合医院就诊的23例PE妊娠期女性和25例健康妊娠期女性的胎盘标本(孕32～40周)。术后(PE妊娠期女性行剖宫产术，健康妊娠期女性行引产术及会阴侧切术)立即将胎盘组织在液氮中快速冷冻，-80 ℃保存，待进一步试验。

PE的诊断标准:既往血压正常，孕20周后，收缩压≥140 mm Hg或舒张压≥90 mm Hg，24 h尿蛋白≥0.3 g[9]。纳入标准：孕32～40周，符合PE诊断标准的妊娠期女性，自愿参与。排除标准:高血压高危情况、血液系统疾病和异常妊娠与其他产科并发症。本研究经南京市中西医结合医院伦理委员会批准，所有患者均签署书面知情同意。PE妊娠期女性年龄19～34岁，平均(25.12±4.11)岁；体质量指数(BMI)(24.41±2.78)kg/m2；收缩压(154.06±7.65)mm Hg；舒张压(102.25±6.48)mm Hg；尿蛋白(3.67±0.73)g/24 h；孕周(35.33±3.28)周；胎儿体质量(2.28±0.52)kg。健康妊娠期女性年龄22～31岁，平均(25.37±3.19)岁；BMI(25.63±3.10)kg/m2；收缩压(109.55±5.93)mm Hg；舒张压(70.69±5.07)mm Hg；尿蛋白未检出；孕周(36.05±3.10)周；胎儿体质量(3.16±0.74)kg。两组年龄和BMI比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器与试剂 人滋养层细胞HTR-8/SVneo、AR和JEG-3及人胚肾细胞293T购自中国科学院细胞库；RPMI-1640完全培养基、胎牛血清购于Gibco公司；反转录试剂盒和SYBR试剂盒购于Takara公司。引物购于上海生工公司。荧光素酶报告基因检测盒购于Promega公司。JNK1抗体和GAPDH购于Abcam公司。Lipofectamine 3000试剂购于Invitrogen公司；SDS试剂盒、抗体稀释液、磷酸盐缓冲液(PBS)购于碧云天公司。 miR-433 mimic、anti-miR-433及各自的阴性对照物(miR-NC和anti-miR-NC)、JNK1过表达质粒及其阴性对照均来自上海GeneChem公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养与转染 HTR-8/SVneo细胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基置于37 ℃，5%CO2培养箱中进行培养。细胞转染按照Lipofectamine 3000试剂说明书进行操作，具体方法如下：将处于对数生长期的细胞进行消化，将消化后的细胞接种于6孔板内，使细胞融合度为60%左右，将细胞置于培养箱中培养。24 h后更换新鲜培养基，加入目的质粒2.5微克/孔，加入转染试剂4.5 μL，“十”字法混匀后置于培养箱中培养。转染48 h后，处理细胞进行进一步试验。

1.3.2qRT-PCR 使用Trizol试剂(美国Thermo公司)根据试剂操作说明提取细胞和组织总RNA。采用NanoDrop 2000(美国Thermo公司)对提取的RNA进行定量。通过Semi qRT-PCR来定量miRNA。每一次Semi qRT-PCR反应使用1 μg总RNA。将miR-433的表达正常化为U6表达作为内源性调控。采用qRT-PCR检测JNK1表达，选择GAPDH作为内参基因。qRT-PCR反应条件和体系参照SYBR试剂盒说明书进行。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.3划痕试验 采用划痕试验测定细胞迁移能力。方法如下：将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶进行消化，用RPMI-1640完全培养基进行重悬，取1×105个细胞接种于12孔板中，将12孔板放在培养箱中培养。待细胞融合度达到90%左右，用200 μL Tip在孔内划3条直线，用PBS吸取刮下来的细胞，更换RPMI-1640无血清培养基培养。分别在0和24 h采用显微镜进行拍照，记录创面的宽度，计算细胞迁移距离。

1.3.4迁移侵袭试验 将转染后的HTr-8/SVneo细胞用胰酶进行消化，PBS洗涤，采用无血清的RPMI-1640培养基将细胞重悬后，计数，调整细胞浓度。将Transwell小室(迁移侵袭试验需用基质胶将小室进行包被)，插入24孔板内，在小室上室内加入1×104个细胞(迁移侵袭试验细胞数为2×104)。在下室内加入500 μL含10%胎牛血清的LRPMI-1640完全培养基。在37 ℃、5% CO2的条件下培养24 h后，取出小室，用棉签将附着在膜上方的细胞去除。将膜下方的细胞采用甲醇固定20 min，之后用0.1%结晶紫染色10～15 min，采用光学显微镜(DMI6000 B显微镜)对染色的细胞进行拍照，计数每个视野内的细胞数。

1.3.5Western blot 采用RIPA试剂裂解细胞，收集细胞总蛋白。30 μg蛋白通过12%SDS凝胶电泳分离，然后转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶在Tris缓冲盐溶液中室温封闭1 h，洗涤后用兔抗人JNK1抗体(1∶2 000稀释)、GAPDH抗体(1∶2 000稀释)在4 ℃孵育过夜。洗涤后用带有相应的辣根过氧化物酶标记兔二抗(1∶8 000稀释)在室温下避光孵育2 h。采用增强化学发光系统(美国Thermo公司)检测蛋白印迹。

1.3.6双荧光素酶报告基因试验 为了研究miR-433抑制滋养层细胞侵袭和迁移的机制，笔者利用TargetScan和miRanda来预测miR-433的直接靶基因并选择JNK1作为miR-433的候选靶基因进行进一步评估。在pmirGLO载体的SacI/XboI限制性位点之间插入带有miR-433结合位点的JNK1的3′-UTR构建质粒pmirGLO-WT-JNK1。通过去除miR-433的结合位点构建pmirGLO-MUT-JNK1质粒。使用lipo3000将pmirGLO-WT-JNK1/pmirGLO-MUT-JNK1和miR-433 mimic或miR-NC共转染到293T细胞中。转染36 h后，使用双荧光素酶报告基因检测系统(美国Promega公司)检测荧光素酶活性。

2 结 果

2.1miR-433在PE患者胎盘组织中的表达情况 与正常胎盘组织比较，PE患者胎盘组织内miR-433表达明显上调，见图1。此外，在HTR-8/SVneo、JAR和JEG-3 3种滋养层细胞株中，miR-433在JAR细胞中表达最高，在HTR-8/SVneo细胞中表达最低，见图2。随后采用划痕试验检测了上述3种滋养层细胞的迁移能力，发现miR-433表达最高的JAR细胞的迁移能力最弱，明显低于miR-433表达最低的HTR-8/SVneo细胞，见图3。

注：与正常胎盘组织比较，aP<0.01。

注：与JAR细胞比较，aP<0.05;与JEG-3细胞比较，bP<0.05。

注：与JAR细胞比较，aP<0.05;与JEG-3细胞比较，bP<0.05。

2.2miR-433抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭能力 通过使用miR-433 mimic和anti-miR-433转染细胞来干扰miR-433的表达进而评估miR-433对HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的影响。与转染阴性对照细胞(miR-NC)相比，转染miR-433 mimic后，通过Transwell孔的细胞数量明显减少，表明miR-433过表达后细胞迁移和侵袭能力降低，见图4、5。除此之外，与阴性对照细胞(anti-miR-NC)相比，转染anti-miR-433后，通过Transwell孔的细胞数量明显增多，表明抑制miR-433表达后细胞迁移和侵袭能力增加，见图6、7。

注：A、B为分别转染miR-NC和miR-433 mimic后HTR-8/SVneo细胞的迁移情况；C、D为分别转染miR-NC和miR-433 mimic后HTR-8/SVneo细胞的侵袭情况。

注：与miR-NC比较，aP<0.05。

注：A、B为分别转染anti-miR-NC和anti-miR-433后HTR-8/SVneo细胞的迁移情况；C、D为分别转染anti-miR-NC和anti-miR-433后HTR-8/SVneo细胞的侵袭情况。

注：与anti-miR-NC比较，aP<0.05。

2.3JNK1为miR-433的下游靶基因 结果显示，与miR-433共转染后，荧光素酶相对活性明显下降，说明miR-433直接抑制JNK1，见图8、9。此外，通过Western blot检测miR-433对JNK1表达的影响，结果表明，miR-433转染明显抑制了HTR-8/SVneo细胞中JNK1蛋白的相对表达水平，见图10。

图8 JNK1 mRNA与miR-433相互作用的野生型(WT)和突变型(MUT)3′-UTR序列

注：与miR-NC比较，aP<0.05。

图10 转染miR-433 mimic或miR-NC的HTR-8/SVneo细胞中JNK1蛋白相对表达水平

2.4miR-433通过抑制JNK1的表达影响HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭能力 为了进一步验证miR-433通过JNK1影响滋养层细胞的迁移和侵袭能力，笔者将miR-433 mimic和JNK1共转染至HTR-8/SVneo细胞，采用Transwell迁移侵袭试验检测在过表达miR-433的细胞中重新表达JNK1对细胞迁移侵袭能力的影响，结果显示，过表达JNK1能逆转miR-433对HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的抑制作用(P<0.001)，见图11、12、13。以上结果表明，miR-433通过抑制JNK1的表达影响HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭能力。

注：A、B、C为分别转染miR-NC、miR-433 mimic、miR-433 mimic+JNK1后HTR-8/SVneo细胞的迁移情况；D、E、F为分别转染miR-NC、miR-433 mimic、miR-433 mimic+JNK1后HTR-8/SVneo细胞的侵袭情况。

注：A为迁移细胞数情况，B为侵袭细胞数情况；与miR-433比较，aP<0.05。

图13 miR-NC、miR-433 mimic及miR-433 mimic+JNK1单独或共转染至HTR-8/SVneo细胞中JNK1蛋白相对表达水平

3 讨 论

PE的发病机制很复杂，多种因素影响PE的发生[10-11]。研究发现，人滋养层细胞的异常增殖和侵袭在PE的发展中起着至关重要的作用[12-14]。因此，研究滋养层细胞增殖和侵袭的机制，为治疗PE寻找新的有效的分子靶点具有重要意义。越来越多的研究表明，PE患者胎盘组织中mi-RNA表达存在异常[15-18]。PE患者胎盘组织中表达异常的mi-RNA及其靶基因的鉴定为研究PE的发生提供了基础[19]。本研究发现，PE患者胎盘miR-433表达上调，且JNK1被确定为miR-433的下游靶基因，miR-433的上调通过靶向JNK1抑制滋养层细胞的迁移与侵袭，参与PE的发生、发展。

前期研究发现，miR-433在多种疾病中发挥重要作用，且miR-433影响多种肿瘤细胞的迁移和侵袭[20-24]。因此笔者猜想它可能影响PE的发生、发展。本研究结果发现，在PE患者胎盘组织中，miR-433明显高表达。同时，在滋养层细胞内，抑制miR-433的表达可促进细胞的迁移和侵袭，而过表达miR-433可抑制细胞迁移和侵袭。为了探究miR-433影响细胞迁移侵袭的机制，笔者采用生物信息学分析和双荧光素酶报告基因试验发现，JNK1为miR-433的下游靶基因，过表达的miR-433可抑制JNK1的表达。这与miR-433在肿瘤组织中的研究存在差异[23]。可能的原因是miR-433通过不同靶点在不同疾病中发挥不同作用。如在非小细胞肺癌组织和细胞中，miR-433表达下调，并通过降低基质金属蛋白酶(MMP)-2/金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-2和MMP-9的表达而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭[20-25]。在乳腺癌中miR-433通过靶向MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞生长[26]。在食管鳞状上皮细胞癌中，miR-433通过靶向GRB2抑制食管鳞癌细胞的增殖和侵袭[27]。此外，TAO等[28]发现，在心脏纤维化的心脏病模型中，miR-433明显高表达，在新生大鼠心肌成纤维细胞中过表达miR-433可以促进细胞增殖并向肌成纤维细胞分化。值得注意的是，由于miR-433存在多个靶点，并不局限于JNK1，因此，笔者还需要进一步研究其他潜在的靶基因，以进一步研究miR-433在PE发生过程中的调控网络。

此外，笔者还研究了miR-433是否通过下调JNK1在HTR-8/SVneo细胞中发挥作用。结果发现，JNK1的过表达部分逆转了miR-433对滋养层细胞迁移和侵袭的抑制作用。总的来说，目前的数据表明miR-433通过靶向JNK1参与了PE的发生，这表明miR-433/JNK1通路可能是PE治疗的一个新靶点。此外，SAUL等[29]发现，在重度PE患者中，妊娠早期母体血清中miR-433表达上调。因此，未来可以进一步探究miR-433在母体血清中的表达情况。

综上所述，本研究结果提示，miR-433在PE患者胎盘组织中高表达，miR-433可能通过靶向JNK1抑制滋养层细胞的迁移和侵袭，参与PE的发生、发展。因此，靶向调节miR-433/JNK1通路的治疗方法可能可以改善PE的治疗。