多重基因甲基化分析在宫颈癌诊断中的应用研究

王娟娟，荣婷婷，郑英霞，朱威南，沈立松

上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092

宫颈癌是一种可预防、可治愈的疾病，却也是全球女性中发病率和病死率均排名第4位的癌症[1]。据GLOBOCAN 2020年的数据，全球宫颈癌每年新发病例近60万例，病死病例约34.2万例[2]。早期发现的宫颈癌患者其5年生存率为92%，而宫颈癌筛查成为提高早诊率、降低病死率的主要途径。巴氏涂片法是最早用于宫颈癌筛查的检测方法，但灵敏度低，容易发生漏检[3]。液基细胞学虽然提高了细胞学检查的准确性，但灵敏度和特异度与传统的细胞学检查方法没有明显差异[4]。人乳头瘤病毒(HPV)检测具有很高的灵敏度和阴性预测值[5]，但不足以提供准确的预测，因为并非所有HPV亚型感染都将导致子宫颈癌的发生[6]。本研究针对CADM1、C13ORF18、PCDHA4和TERT 4种基因，收集不同病变类型的宫颈脱落细胞标本，检测每个基因的甲基化水平，研究其单项或联合检测与宫颈癌发生、发展的联系，并结合高危HPV检测及病理结果，综合分析它们在识别宫颈癌及癌前病变中存在的价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019年9月至2020年8月在上海交通大学医学院附属新华医院妇科就诊的101例女性患者的宫颈脱落细胞，其中低级别鳞状上皮内病变(LSIL)51例作为LSIL组，高级别鳞状上皮内病变(HSIL)28例作为HSIL组，宫颈癌22例作为宫颈癌组，101例患者均在阴道镜下活检获得组织标本进行病理学确诊。其中有76例患者进行TCT检查。同时，采集20例健康女性的宫颈脱落细胞作为对照组。本研究经本院伦理委员会批准，所有入组研究对象均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 仪器和试剂检测均严格按说明书进行操作。SLAN-96S实时定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)、Centrifuge 5417R高速冷冻离心机(Eppendorf公司)、GL-1800恒温金属浴(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、电泳仪(上海天能科技有限公司)、凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)、NanoDrop 2000(赛默飞世尔科技公司)。核酸提取试剂盒(上海之江生物科技股份有限公司)、HPV高危亚型检测试剂盒(上海之江生物科技股份有限公司)、PCR检测试剂盒(上海之江生物科技股份有限公司)、M.SssI酶(NEB公司)、核酸提取或纯化试剂(苏州海苗生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1宫颈脱落细胞的基因组DNA提取 采用Autrax全自动核酸提取工作站提取宫颈脱落细胞中的人基因组DNA和HPV DNA，提取的DNA使用NanoDrop 2000进行测量，保存于-20 ℃冰箱备用。

1.3.2MSP甲基化引物设计 利用MethPrimer、NCBI primer-blast等网站进行5个基因甲基化和非甲基化引物的设计(ACTB为内参基因，具体序列见表1)，并将引物送出合成。

表1 9对基因引物序列表

续表1 9对基因引物序列表

1.3.3HPV DNA的检测 采用HPV高危亚型检测试剂盒对脱落细胞基因组DNA进行HPV16/18的PCR检测。

1.3.4阳性对照制作 提取对照组外周血白细胞的基因组DNA，采用M.SssI酶处理后作为甲基化引物的阳性对照待用。

1.3.5重亚硫酸盐修饰 采用核酸提取或纯化试剂对提取的人脱落细胞基因组DNA和M.SssI酶处理后的阳性对照DNA进行重亚硫酸氢盐处理并纯化，按试剂盒说明书操作。目的是将DNA中的非甲基化C转化为U，然后通过PCR扩增转化为T。

1.3.6配制PCR反应混合液 按照厂家(上海之江生物科技股份有限公司)说明书配制PCR反应混合液，将重亚硫酸盐修饰后的基因组DNA加入混合液，上机进行PCR扩增，扩增条件如下：95 ℃，15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40个循环；72 ℃，10 min。

1.3.7琼脂糖凝胶电泳 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度3%，电压120 V。

2 结 果

2.1各组一般资料比较 121例女性的年龄(46.91±13.89)岁，其中对照组(44.00±12.85)岁，LSIL组(45.69±13.37)岁，HSIL组(44.93±15.01)岁，宫颈癌组(54.91±12.40)岁。宫颈癌组≥55岁人数比例高于对照组、LSIL组和HSIL组(P<0.01)。对照组和不同病变程度的宫颈病变组中，HPV16/18的阳性率随着病变程度增加呈上升趋势(P<0.01)。76例患者的TCT检查结果见表2。

表2 各组一般资料情况(n)

2.2琼脂糖凝胶电泳结果 4对甲基化引物、4对非甲基化引物及1对人基因组内参引物的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后确认目的基因长度，见图1，并送上海生工进行克隆测序，确定目的基因序列。

2.34组间4种基因的甲基化水平差异分析 CADM1和PCDHA4基因的甲基化阳性率在LSIL组、HSIL组、宫颈癌组和对照组4组间的差异无统计学意义(P>0.05)，C13ORF18和TERT基因的甲基化阳性率在4组间的差异均有统计学意义(P<0.01)。CADM1基因的甲基化阳性率在对照组、LSIL组、HSIL+宫颈癌组3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；PCDHA4基因的甲基化阳性率在对照组、LSIL组、HSIL+宫颈癌组3组间随着病变程度增加而升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4种基因在不同宫颈病变患者及对照组中的甲基化阳性情况

2.4C13ORF18基因甲基化检测、TERT基因甲基化检测与HPV16/18检测单项或联合检测时对于宫颈癌的诊断效能 C13ORF18基因甲基化检测与HPV16/18二者联合检测，以及C13ORF18基因甲基化检测、TERT基因甲基化检测与HPV16/18三者联合检测时，特异度均为96.97%，但三者联合检测具有更高的阳性预测值(75.00%)。TERT基因甲基化单项检测灵敏度和阴性预测值均最高，分别为86.36%、94.74%。见表4。

表4 不同检测方法对宫颈癌的诊断效能(%)

2.5C13ORF18基因甲基化检测、TERT基因甲基化检测与HPV16/18检测单项或联合检测在TCT检查结果为不能明确意义的不典型鳞状细胞(ASCUS)患者中区分高级别及以上病变的诊断效能 当TCT检查结果为正常或ASCUS时，HPV16/18检测筛查高级别级以上病变的检测灵敏度最好(分别为100.00%和71.43%)，且具有较好的阴性预测值。C13ORF18基因甲基化检测具有较好的特异度，均高达100.00%，且具有较好的阳性预测值。HPV16/18与C13ORF18基因甲基化联合检测的灵敏度低于HPV16/18单项检测，同时与C13ORF18基因甲基化单项检测比较，虽特异度一致，但灵敏度没有提高，甚至在ASCUS的TCT结果诊断中明显下降。TERT基因甲基化检测无论是单项还是联合HPV16/18检测,灵敏度均不及HPV16/18单项检测，特异度也不及C13ORF18基因甲基化单项检测，见表5、6。

表5 C13ORF18甲基化检测、TERT基因甲基化检测与HPV16/18检测单项或联合检测在正常TCT结果中诊断高级别及以上病变的诊断效能(%)

表6 C13ORF18甲基化检测、TERT基因甲基化检测与HPV16/18检测单项或联合检测在ASCUS的TCT结果中诊断高级别及以上病变的诊断效能(%)

3 讨 论

高危HPV亚型的感染是导致宫颈癌发生的主要原因[7]，但是高危HPV亚型感染并不一定能够促使最终发展为宫颈癌，仅有少部分人HPV持续性感染会发展为子宫颈病变。本研究中宫颈癌组的女性年龄明显高于对照组、LSIL组和HSIL组，且HPV16/18的阳性率随着宫颈病变程度的增加而增高，也证实了高危HPV亚型的持续感染在子宫颈癌及癌前病变中的关键作用。

目前对于宫颈癌的筛查策略主要采用细胞学检查或主要的高危HPV亚型检测，分别侧重于检测异常细胞和是否存在高危HPV亚型感染。传统宫颈巴氏涂片可以诊断宫颈癌病变，但灵敏度低，假阴性率非常高，容易导致临床误诊和漏诊[8]。TCT检查提高了细胞学检查的阳性率，但其受标本采集及制片的影响[9]，本研究中76例患者的TCT检查结果也证实了细胞学检查的局限性；而高危HPV亚型筛查不能区分一过性感染和持续性转化感染，降低了筛查的特异度，这表明需要采取更加客观的筛查策略。

DNA甲基化是修饰DNA的一种方式，其不改变基因组DNA，仅改变表观遗传表现，是细胞维持基因稳定和调节基因表达的主要因素[10]。DNA甲基化主要机制是在DNA甲基化转移酶(DNMT)的催化作用下，使胞嘧啶磷酸鸟嘌呤二核苷酸(CpG)5′端C原子与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的活性甲基发生共价结合，形成DNA的甲基化修饰。CpG岛中的大多数CpG在正常细胞中通常未甲基化，CpG的超甲基化是在肿瘤细胞中经常观察到的变化之一，这可能导致肿瘤抑制基因沉默[11]。因此，基因甲基化可能是宫颈癌诊断的潜在生物标志物。目前在宫颈组织中已检测出超过 100 种基因甲基化标志物[12]，赵娟等[13]研究发现，宫颈癌和癌旁组织中的 SALL3 基因启动子区甲基化水平明显高于正常宫颈组织。尽管如此，病理组织标本取样烦琐，并不适用于一般人群筛查。有报道显示，宫颈脱落细胞基因甲基化检测可应用于宫颈癌早期筛查，并可能成为更加灵敏、特异的手段[14]。近年来国内也有许多关于宫颈脱落细胞如PAX1[15]、FAM19A4[16]等基因甲基化的研究，结果也提示了宫颈脱落细胞基因甲基化的检测在宫颈癌及癌前病变筛查中具有一定临床应用价值。

CADM1，又称肺癌肿瘤抑制因子1(TSLCl)，主要发挥维持细胞间黏附稳定及细胞骨架构建的功能。在许多实体瘤(如胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、食道癌和宫颈癌)中，CADM1经常被启动子高甲基化灭活[17]，有研究发现，CADMl与MAL基因甲基化异常与高级别宫颈病变更高的阳性率相关[18]。C13ORF18为13号染色体开放阅读框18，C13ORF18的启动子甲基化会导致细胞周期的破坏，可能是宫颈癌发生的早期事件[19]。原钙黏蛋白(PCDH)是细胞黏附分子超家族中最大的一员，分为α、β、和γPCDH基因簇(根据人类基因组组织命名法分别对应PCDHA@、PCDHB@和PCDHG@)，在5q31号染色体上串联分布，PCDHA4是PCDHA@中的一种。有研究显示，与HPV检测相比，对于宫颈上皮内瘤变2级病变的早期检测，PCDHA4的甲基化检测具有相同的灵敏度，但特异度更高[20]。TERT是细胞内一种与癌变密切相关的反转录酶，其基因启动子区异常甲基化已被证实存在于包括宫颈癌[21]在内的多种肿瘤组织中。

GUSTAFSON等[22]对液基细胞学标本中15种基因甲基化进行研究，结果显示，CADMl基因甲基化检测是区分高级病变与正常及低级别病变最好的标志物。VAN BAARS等[23]的研究也显示了相似的结果，CADM1基因甲基化随着病变严重程度的增加而增加，并且是病变特异性的标志物。而本研究结果表明，CADMl基因甲基化阳性率在4组间差异无统计学意义(P>0.05)，并在低级别和高级别及以上病变之间差异无统计学意义(P>0.05)，这可能是由研究人群的种族、地域差异造成的。

WANG等[20]的研究显示，正常对照、癌前病变(CIN)1级、CIN2/3级和子宫颈癌中PCDHA4基因甲基化阳性率随着病变程度增加明显增高，而本研究中该基因甲基化阳性率在4组间差异无统计学意义(P>0.05)，可能原因为本研究宫颈癌患者例数太少。然而，该基因甲基化阳性率在对照组、LSIL组和HSIL+宫颈癌组3组间差异有统计学意义(P<0.05)，说明PCDHA4基因的甲基化检测有助于区分低级别和高级别及以上的病变。

YANG等[24]等的研究显示，对于区分正常和CIN2级及以上的病变，C13ORF18基因甲基化是良好的检测标志物。也有试验证实，宫颈刮片中的C13ORF18启动子甲基化与高级别病变密切相关[25]。本研究结果显示，对照组、LSIL组、HSIL组和宫颈癌4组间的C13ORF18基因甲基化阳性率随着病变程度的加深而明显增高(P<0.01)，且C13ORF18基因甲基化单项检测用于诊断宫颈癌，显示出了较好的特异度(93.94%)，并优于HPV16/18(75.76%)和TERT基因甲基化(54.55%)单项检测。

EIJSINK等[26]的研究显示，TERT基因甲基化阳性率在正常、CIN1、CIN2、CIN3和宫颈癌的冰冻宫颈组织中分别为8%、16%、14%、51%、90%，而本研究中该基因在宫颈脱落细胞中也有相似的结果，该基因甲基化阳性率在对照组、LSIL组、HSIL组和宫颈癌组中随着病变程度增加而增加(P<0.05)，TERT基因甲基化单项检测用于诊断宫颈癌的灵敏度为86.36%，高于C13ORF18基因甲基化(59.09%)和HPV16/18(68.18%)单项检测，但特异度比C13ORF18基因甲基化和HPV16/18单项检测低。

对C13ORF18基因甲基化、TERT基因甲基化联合HPV16/18检测诊断宫颈癌的综合分析结果显示，C13OFR18基因甲基化检测联合HPV16/18检测可以略微提高检测特异度(从93.94%提升至96.97%)，但是灵敏度大大降低(从59.09%降至45.45%)；TERT基因甲基化检测联合HPV16/18检测可以提高特异度至85.86%，但不及C13ORF18基因甲基化单项检测的特异度高，且灵敏度较低；三者联合检测特异度与C13OFR18基因甲基化检测联合HPV16/18检测的特异度相同，但检测灵敏度较低。

此外，本研究结果显示，HPV16/18检测和C13ORF18基因甲基化检测可能有助于对于细胞学检查后进一步进行危险分层。对于正常或ASCUS的TCT检查结果，HPV16/18检测对于区分宫颈高级别及以上病变具有很高的灵敏度(分别为100.00%和71.43%)，而C13ORF18基因甲基化检测的特异度均高达100.00%。

综上所述，宫颈脱落细胞CADM1、PCDHA4、TERT和C13ORF18这4种基因中，TERT基因和C13ORF18基因甲基化单项检测在宫颈癌及癌前病变的筛查中体现了较好的临床价值，但是联合HPV16/18的筛查并不能明显提高诊断性能。HPV16/18检测和C13ORF18基因甲基化检测对于细胞学检查后进一步进行危险分层具有一定的临床意义。本研究样本量尤其是宫颈癌患者病例较少，宫颈癌标本临床资料不够全面，未来可扩大研究人群，补充临床资料，并结合更多的基因进一步研究。