基于质谱技术对森林脑炎患者血清代谢组学的研究*

王晓艳，李 翔，肖 翔，陆德生，张仕华，杜彦丹

内蒙古林业总医院/内蒙古民族大学第二临床医学院，内蒙古呼伦贝尔 021000

森林脑炎是一种由蜱传森林脑炎病毒引起的发热性疾病，严重时会对中枢神经造成一定程度损伤[1]。森林脑炎主要流行于欧洲及亚洲东北部林区，近年来随着生态旅游业的发展，感染人群范围持续扩大，严重影响人民健康及经济发展[2]。森林脑炎是一种自抑性疾病，机体主要凭借自身抗炎作用进行自我修复，目前仍无特效治愈方式[1,3]，且病毒入侵机体产生的促炎及抗炎作用机制还未被揭示。代谢组学凭借高通量技术和先进的数据分析方法，捕捉生物体内代谢通路变化，从而系统揭示机体的整个代谢变化，在系统科学中占据举足轻重的位置[4-7]。笔者前期基于流式细胞技术分析了病毒侵染后机体与细胞免疫因子的相关性，为寻找与疾病病程相关的靶向标志物，笔者对森林脑炎患者和健康人群进行了代谢组学检测，并结合多元分析以阐释疾病发病机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 50例森林脑炎患者(森林脑炎组)为呼伦贝尔牙克石市附近居民，有蜱虫叮咬史，且出现发热、四肢疼痛等症状，经血清学检测，神经内科专家鉴定为森林脑炎。森林脑炎组中男39例，女11例；年龄25～68岁；IgG或IgM抗体呈阳性。健康对照组为内蒙古林业总医院职工体检健康者39例，其中男19例，女20例；年龄22～59岁；IgG或IgM抗体呈阴性。所有受试者均签署了知情同意书。

森林脑炎组纳入标准：符合《职业性森林脑炎诊断标准》[8]；外周血清特异性抗体IgM或IgG呈阳性，且IgM或IgG≥1∶20；年龄18～70岁。排除标准：近期有疫苗接种史；妊娠期、哺乳期。健康对照组纳入标准：特异性抗体IgM或IgG呈阴性。排除标准：有蜱虫叮咬史及森林脑炎疫苗接种史；患有其他疾病。

1.2仪器与试剂 LC-30AD液相色谱仪，日本岛津公司；Triple TOF 5600质谱检测器，美国AB Sciex 公司。甲醇(MEOH)、乙腈(ACN)试剂均为Optimal MS级别，美国Fisher Chemical公司生产；超纯水为屈臣氏超纯水；醋酸铵(纯度≥98%)、氨水(纯度28%～30%)购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.3实验方法

1.3.1标本前处理 取血清标本300 μL，加入900 μL提取液[ACN∶H2O=4∶1(V/V)]，旋涡混匀30 s，-20 ℃静置1 h后于4 ℃，12 000 r/min离心15 min；小心取出600 μL上清液，等体积加入至两个独立的EP管中并在真空浓缩仪中干燥提取物；向干燥后的代谢物中加入200 μL提取液(提取液为初始梯度的流动相)，旋涡30 s。将标本于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，小心取出75 μL上清液于2 mL进样瓶上机检测。等体积血清标本各3 μL，标本混合后为质量控制样(QC)。QC标本随机穿插在标本序列中多次进样，以监测仪器与方法的稳定性。

1.3.2检测分析 为了全面覆盖标本信息，采用非极性色谱柱及极性色谱柱进行生物标本的分离。针对中等极性及弱极性小分子化合物：色谱柱采用Acquity HSS T3 Column(以下简称T3色谱柱，1.8 μm,2.1 ×100 mm)，美国Waters公司；梯度洗脱采用流动相A：H2O(0.1% FA)；B：MEOH∶ACN=1∶1(V/V)。流速为0.3 mL/min；进样量为5 μL；柱温为40 ℃。梯度洗脱程序信息见表1，质谱相关参数信息见表2。

表1 梯度洗脱程序详细参数

表2 质谱详细参数

针对强极性小分子代谢物：色谱柱采用Acquity UPLC BEH Amide Column(以下简称BEH Amide色谱柱，3 μm,2.1 mm×100.0 mm)，美国Waters公司；梯度洗脱采用流动相A：H2O(25 mmol/L CH3COONH4+25 mmol/L NH4OH)；B：ACN。流速为0.3 mL/min；进样量为5 μL；柱温为40 ℃。梯度洗脱程序信息见表1，质谱相关参数信息见表2。

1.4统计学处理 质谱采集到的UPLC-QTOF-MS图谱采用Analyst Software(美国AB Sciex公司)导出原始数据，通过基峰离子流色谱图(BPC)及总离子流色谱图(TIC)等判断数据及平台的可靠性。随后利用XCMS plus及Markerview对采集到的潜在标志物进行定性及定量分析。将包含质荷比-保留时间、标本信息与峰面积三维数据进行校正后，将数据导入网络版MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca/)进行数据的归一化、去除同位素等处理，并进行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS)等多元统计分析，筛选潜在标志物，并归属相应代谢通路，以寻求代谢通路变化与疾病之间的相关性。

PCA属无师监督法，该处理法则主要是对标本信息进行降维处理，能够实现标本分组的可视化分析，且不会造成重要信息的丢失，并对于建模的情况进行评估[9]。PCA模型的建立主要用于评估实验建模的成功与否，其主要依据于QC标本的聚集程度，QC标本随机穿插在进样序列中，QC标本的聚拢程度可反映平台的可靠性及实验方法的重复性。OPLS主要依据多元统计变量VIP值、单变量P值及差异倍数值(FC)法则，对于标本之间的代谢物进行筛选挖掘[10]。筛选到的潜在标志物依据同位素模型分布原则、元素组成分析原则，缩小目标化合物范围，在标准谱库如京都基因和基因组数据库(KEGG)、人类代谢组数据库(HMDB)进行进一步筛选，依据实际谱图与标准谱图的对比匹配系数，进一步确定物质属性。对于获得的潜在标志物进行代谢通路富集分析，建立通路变化与生物背景之间的纽带，解释其生物学意义。

2 结 果

2.1BPC结果 血清标本正离子模式下基于T3色谱柱的图谱见图1。从图中可以看出，色谱峰的峰型良好，进一步证实检测平台的可靠性。经80%去零规则消除缺失值，基于T3色谱柱正离子模式共鉴定到166个代谢物，BEH Amide色谱柱正负离子模式下分别得到181、182个代谢物，3种模式下，去掉重复信号，共得到410个代谢物。

图1 森林脑炎组血清标本正离子模式下基于T3色谱柱的基峰离子流色谱图

2.2PCA结果 从图2可以看出，基于T3色谱柱及BEH Amide色谱柱，QC标本的聚集度均良好，表明建模的可靠性。

注：H为健康对照组；QC为质控组；T为森林脑炎组；A为T3色谱柱正离子模式下PCA图，组成分PC1=67.2%，PC2=3.8%；B为BEH Amide色谱柱正离子模式下PCA图，组成分PC1=55.6%，PC2=9.1%；C为BEH Amide色谱柱负离子模式下PCA图，组成分PC1=21.1%，PC2=11.9%。

2.3差异代谢物提取和解析 基于UPLC-QTOF-MS血清代谢组学技术，在森林脑炎组和健康对照组中可鉴定到410个代谢物，这些物质同时经二级谱库精确鉴定。利用XCMS plus及METLIN对生物学标志物进行筛选，MetDNA进行物质鉴定，实现了拟靶向分析。其中144个代谢物在两组之间差异有统计学意义(P<0.05，VIP>1，FC>1.0)，所涵盖的差异代谢物中，氨基酸水平整体呈下降趋势，且脂肪酸水平同样表现为下降趋势。通过代谢通路富集分析，差异代谢物主要涵盖了氨基酸、脂肪酸、花生四烯酸、白三烯等物质，所富集代谢通路主要为氨基酸代谢通路及与脂类代谢密切相关的代谢通路(包括脂蛋白生物合成、脂肪酸合成、花生四烯酸生物合成、白三烯生物合成等)。两组间主要差异代谢物见表3。

表3 健康对照组与森林脑炎组的主要差异代谢物

续表3 健康对照组与森林脑炎组的主要差异代谢物

3 讨 论

本研究结果表明，差异代谢物主要集中于氨基酸、脂肪酸、花生四烯酸、白三烯等物质，所富集代谢通路主要为氨基酸代谢通路，另外也发现了与脂类代谢密切相关的代谢通路，包括脂蛋白生物合成、脂肪酸合成、花生四烯酸生物合成、白三烯生物合成。脂肪酸合成、花生四烯酸合成、白三烯生物合成通路代谢紊乱与机体对病毒入侵所做出的免疫反应有着直接联系[11]。氨基酸水平整体呈下降趋势，这与大量病毒的入侵有关，病毒在机体内大量繁殖，需借助机体内氨基酸作为基底物质维持其生长，供自身细胞蛋白合成代谢所需[12]。同时，本研究监测到脂肪酸水平呈下降趋势，这主要与宿主机体的机能有关，病毒在机体的复制、繁殖都需要能量供应，导致脂肪酸水平的降低。另外，脂质是细胞膜的主要组成成分，细胞膜的正常运行能够保证细胞内环境的相对稳定，使各种生化反应能够有序运行。病毒的入侵扰乱了机体的正常代谢，细胞做出相应的应激反应，细胞膜流动性发生了改变，从而导致脂类代谢紊乱[13]。

内源性花生四烯酸的产生主要是通过细胞膜磷脂的释放来实现的。这一过程由磷脂酶A2家族酶催化，并由多种细胞激活信号诱导，包括炎症或感染驱动的肿瘤坏死因子受体和Toll样受体4的刺激[14]。花生四烯酸的代谢对于人体健康和组织稳态调节具有重要意义。花生四烯酸参与调节细胞膜灵活性和流动性，在细胞信号传导中作为脂质第二信使，诱导血管舒张及炎症介质产生，参与病毒入侵过程机体出现的炎性反应[15-16]。

病毒的复制依赖于宿主的代谢机制和必要的细胞因子。氨基酸在所有病毒相关感染的发病机制中都发挥着重要作用，它们既是蛋白质合成的基底物，又是许多代谢途径的调节因子[17-18]。有研究发现，氨基酸的代谢与慢性肝病存在紧密联系，其中支链脂肪酸如缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸等水平在患病组中呈现下降趋势，这可能与丙型肝炎病毒侵染组织并在组织中大量繁殖有关[19]。花生四烯酸及其衍生物能够参与多种代谢途径，将免疫与脂质代谢联系起来，蜱虫叮咬人体后，机体会发生复杂的免疫应答以抵御病毒入侵，患者常会出现相应的炎性反应。急性炎性反应一般包含起始阶段和消退阶段，临床表现为发热、肿胀、疼痛和最终功能丧失等。炎症的起始和消退主要由某些化学物质控制，包括蛋白质、肽和脂类物质(脂类主要包括白三烯和前列腺素等物质)[20]，森林脑炎患者体内花生四烯酸等脂类物质发生明显变化，证实了这一观点。

代谢组学作为基因组学、蛋白组学的下游研究技术，与表征、现象之间的联系更加紧密。病毒侵染机体后，会在体内进行侵染-复制整个过程，机体则会呈现促炎-抗炎等炎性反应。目前关于森林脑炎的代谢过程及机制还未被完全解读，本研究基于代谢组学技术深入剖析森林脑炎的整个机制，将机体炎性反应与代谢特征联系起来，系统挖掘代谢机制，为疾病的诊断及预后提供了基础依据，为后续研究打下了坚实的理论基础。