石家庄市苯丙氨酸羟化酶缺乏症的基因突变研究*

马翠霞，封露露，李丽欣，白 雪，马倩倩，封纪珍△

1.石家庄市妇幼保健院遗传科，河北石家庄 050000；2.石家庄市妇产医院体检中心，河北石家庄 050000

正常情况下，天然食物中的蛋白质分解产生的苯丙氨酸(Phe)在肝脏苯丙氨酸羟化酶(PAH)的作用下转化成酪氨酸，PAH缺乏的患儿可导致高苯丙氨酸血症(HPA)，Phe旁路代谢增强，使得大量苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸从尿中排出，血中增多的Phe可以通过血脑屏障，导致脑内Phe水平增高，引起脑髓鞘发育不良或脱髓鞘等脑白质异常，进而导致神经系统损伤[1]。近些年，虽然随着测序技术的发展，研究者很容易在苯丙酮尿症(PKU)早期患儿中获得准确的分子遗传学诊断结果，但PAH基因变异在不同地区人群中分布不同，代谢表型也存在较大差异，而患儿的基因型又是临床表型的主要决定因素。因此，本研究旨在探讨石家庄新生儿疾病筛查诊治中心确诊的苯丙氨酸羟化酶缺乏症(PAHD)患儿PAH基因突变的规律及特点，为深入开展PAHD的诊断及产前诊断、治疗和遗传咨询提供科学的参考依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年5月至2020年7月在石家庄市新生儿疾病筛查诊治中心确诊的67例PAHD患儿作为研究对象，排除BH4缺乏症及暂时性HPA患儿。其中男37例，女30例；经典型PKU(cPKU)16例，轻度PKU(mPKU)11例，轻度HPA(MHP)40例。本研究经医院医学伦理学委员会批准，所有检查均获得患儿家长或监护人的知情同意，并与监护人签署知情同意书。

1.2诊断标准 根据2014年发表的《高苯丙氨酸血症的诊治共识》[2]，Phe>120 μmol/L(2 mg/dL)及血Phe与酪氨酸(Tyr)比值(Phe/Tyr)>2.0统称为HPA。其中血Phe≥1 200 μmol/L为cPKU；360 μmol/L≤血Phe<1 200 μmol/L为mPKU；120 μmol/L<血Phe<360 μmol/L为MHP。

1.3研究方法 抽取PAHD患儿及父母外周静脉血各4 mL，采血管为2%乙二胺四乙酸二钠抗凝，按照基因组DNA提取试剂盒说明书对所取标本进行核酸提取，使用 Nanodrop2000超微量分光光度计对DNA进行质检，检测合格后进行基因组文库构建。用生物素标记的探针与文库DNA进行杂交，用链霉亲合素修饰的磁珠共价结合生物素标记的探针抓取目的基因，磁力架吸附携带目的基因的磁珠，洗脱纯化，富集目的基因。采用NextSeq500高通量测序仪测序。所有数据应用SOAP SNP程序进行单核苷酸序列多态分析，对于检测到的突变位点严格按照ACMG指南[3]进行致病性分析。对于未报道突变位点，使用生物信息学蛋白功能综合性预测软件REVEL、SIFT、PolyPhen_2、Mutation Taster、GERP+对致病性进行预测。对发现的致病突变在其所在片段上、下游设计引物进行PCR扩增及Sanger测序，从而验证高通量测序的结果，对患儿父母采用Sanger法进行目标基因突变验证。以上基因检测由北京迈基诺医学检验所完成。

2 结 果

2.1PAH基因突变在PAHD患儿中的分布 在67例PAHD患儿的134个PAH等位基因中共检测到134个突变基因位点，61例患儿的PAH基因检测到2个突变位点，其中2例患儿PAH基因为纯合突变，所携带的突变基因分别为c.331C>T/c.331C>T和c.721C>T/c.721C>T，纯合突变率为2.99%(2/67)，59例患儿PAH基因突变为复合杂合突变。3例患儿PAH基因检测到3个突变位点，所携带的突变基因分别为c.158G>A/c.842+2T>A/c.898G>T、c.158G>A/c.842+2T>A/c.1123C>G和c.158G>A/c.158G>A/c.842+2T>A。3例患儿PAH基因检测到1个突变位点。

2.2PAHD患儿PAH基因突变类型及特点 67例PAHD患儿PAH基因序列测定分析结果显示，在134条染色体中总计发现44种突变，134个突变位点,突变位点均经一代测序验证。主要包括错义突变27种(61.36%)，剪接突变8种(18.18%)，无义突变6种(13.64%)，移码突变两种(4.55%)，同义突变1种(2.27%)。134个突变位点分布在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12外显子及第1、4、5、7、8、10、12内含子，其中第2外显子检测到的突变最多，占21.64%(29/134)；其他位置的突变频率由高到低依次为第7外显子(15.67%,21/134),第3外显子(11.19%,15/134),第11外显子(10.45%，14/134)，第6外显子(9.70%，13/134)，第12外显子(9.70%，13/134)。PAH基因突变位点主要有p.R53H(突变频率为20.90%，28/134)，p.R243Q(突变频率为7.46%，10/134)，p.R111X(突变频率为6.72%，9/134)，p.Y204C(突变频率为6.72%，9/134)，c.442-1G>A(突变频率为5.22%，7/134)，p.Y356X(突变频率为3.73%、5/134)，p.R413P(突变频率为3.73%、5/134)，具体突变位点情况见图1。

注：*标注的基因突变位点为本研究中发现的未见报道基因突变位点。

2.3cPKU、mPKU及MHP患儿PAH基因突变位点 石家庄市PAHD患儿基因突变以复合杂合突变为主，在各型患儿中PAH基因高频突变位点有所不同。16例cPKU患儿中共检测到突变12种，其中c.1068C>A和c.331C>T突变频率最高，均为15.63%(5/32)，其次为c.728G>A，突变频率为12.50%(4/32)；纯合突变频率为6.25%(1/16)，其余均为复合杂合突变。

11例mPKU患儿中共检测到突变12种，其中c.721C>T突变频率最高，为18.18%(4/22)，其次为c.1252A>C，突变频率为13.64%(3/22)；纯合突变频率为9.09%(1/11),其余均为复合杂合突变。

40例MHP患儿中共检测到突变33种，其中c.158G>A突变频率最高，为35.00%(28/80),其次为c.611A>G和c.728G>A，突变频率均为6.26%(5/80),均为复合杂合突变，具体情况见表1。

表1 67例PAHD患儿PAH基因突变检测结果

续表1 67例PAHD患儿PAH基因突变检测结果

2.4未报道的PAH基因 在石家庄市新生儿疾病筛查诊治中心确诊的67例PAHD患儿中发现134个PAH基因突变位点，其中有3个突变位点未见报道，分别为c.912+5G>T、c.61-1G>A和c.630T>G，对患儿及其父母进行Sanger测序验证，排除多态性位点可能性，测序结果见图2、3、4。

注：A、B、C分别为PAHD患儿及其父母测序结果，箭头所示为基因突变位置。

注：A、B、C分别为PAHD患儿及其父母测序结果，箭头所示为基因突变位置。

注：A、B、C分别为PAHD患儿及其父母测序结果，箭头所示为基因突变位置。

3 讨 论

PAH基因突变是导致PKU发病的重要原因之一，PAH活性受损或丧失，使得血液中的Phe无法完全代谢，在体内大量蓄积，进一步导致HPA，影响患儿机体和大脑的发育。HPA为常染色体隐性遗传病，是少数可以治疗的遗传代谢病之一。如果通过筛查能够在早期对HPA进行及时确诊和治疗，多数是可以避免其对患儿神经系统造成不可逆损伤的情况。本研究通过对PAHD患儿基因检测结果进行分析总结，不仅补充、完善了石家庄市PAHD患儿的基因突变图谱，并且为PAHD患儿家庭的遗传咨询提供了有价值的信息。

任何一种突变都有可能导致PAH基因结构的改变，从而导致PAH活性的改变，影响Phe的代谢过程。有学者报道，在中国人群中已鉴定出的PAH基因突变有100余种[4]，PAH基因突变在不同地区及人群中分布有所不同，代谢表型也存在较大差异，有研究表明，我国华南地区PAHD的发生率明显低于华北地区，中部和西部地区高于东部地区[5-6]。构建每个地区的 PAH基因突变谱有助于研究基因变异与表型的关系,更好地服务于临床，因此，完善中国不同地区 PAH基因突变谱的构成具有重要意义。本研究中61例患儿PAH基因突变为2个突变位点，其中2例PAH基因为纯合突变基因，所携带的突变基因分别为c.331C>T/c.331C>T和c.721C>T/c.721C>T； 59例患儿PAH基因突变为复合杂合突变。3例患儿PAH基因突变为3个突变位点，所携带的突变基因分别为c.158G>A/c.842+2T>A/c.898G>T、c.158G>A/c.842+2T>A/c.1123C>G和c.158G>A/c.158G>A/c.842+2T>A。3例患儿PAH基因检测到1个突变位点。

PAH基因突变的形式涵盖错义突变、剪接突变、无义突变、移码突变、同义突变等，石家庄市PAH基因突变类型与之前报道的基本一致[7]，主要有错义突变(61.36%)、剪接突变(18.18%)、无义突变(13.64%)等，PAH基因在所有位置都有可能发生基因突变，大多数突变集中在外显子上[8]。PAH基因突变具有高度遗传异质性，突变种类繁多且分布不均，每种突变在不同地区和人群中的发生率存在很大差异，但某些突变位点在某些地区又存在一致性。

石家庄市PAHD患儿基因突变位点主要分布在第2、3、6、7、11和12外显子，这与之前报道的中国和亚洲人群突变情况是一致的[9-11]。然而在不同区域及人群中又存在一定的差异，第2外显子检测到的突变最多，这与文献[9-11]报道的情况又有所不同。

本研究67例PAHD患儿中，54.48%的突变是由7个突变位点引起。最常见的基因突变位点有p.R53H(突变频率为20.90%)、p.R243Q(突变频率为7.46%)、p.R111X(突变频率为6.72%)、p.Y204C(突变频率为6.72%)、c.442-1G>A(突变频率为5.22%)、p.Y356X(突变频率为3.73%)、p.R413P(突变频率为3.73%)。本研究结果发现，石家庄市PAH基因常见突变位点排除了中国南方地区常见的p.R241C和p.R408Q突变[12]。

基因型与临床表型之间具有一定的相关性，PAH基因突变位点的相关研究对指导临床治疗具有重要意义，然而带有相同PAH基因突变的不同PAHD患儿间也存在一定的表型差异，因此，笔者通过分析PAHD患儿的基因突变类型与临床表型之间的关系，可为患儿提供个体化的治疗方案，并且能够更好地为患儿的家庭提供遗传咨询和产前诊断的帮助。

石家庄市PAHD患儿基因突变以复合杂合突变为主，其中突变频率较高的突变位点有：c.158G>A、c.728G>A、c.331C>T和c.611A>G、c.442-1G>A，提示石家庄市在开展PAHD产前基因诊断或进行相关基因突变研究时，需要重点关注上述突变位点，这与国内其他报道既有相似性也有差异性。石家庄市c.158G>A突变频率最高，与青岛市[13]、海南省[14]、安徽地区[15]PAHD患儿的PAH基因突变的特征一致，而该突变位点在云南地区[16]、青海地区[17]、宁夏地区[18]、陕西省[19]、浙江省[12]、内蒙古地区[20]等却不是高频突变位点。c.1068C>A在青岛市[21]突变频率较高，而在石家庄市较低。

PAH基因突变位点c.728G>A、c.331C>T和c.442-1G>A与报道中我国北方群体[22]中PAH基因突变情况一致，但c.611A>G不是该报道中北方群体PAH基因突变频率较高的突变位点，但此突变位点在石家庄市突变频率较高。报道中南方群体[22]中PAH基因的突变位点c.1223G>A(p.R408Q)和c.498C>G(p.Y166X)在石家庄市也不是突变频率较高的突变位点。本研究探讨了石家庄市PAHD患儿的基因突变特点，然而在PAHD各型患儿中突变位点却有所不同，cPKU患儿以c.1068C>A、c.331C>T为主，mPKU患儿以c.721C>T、c.1252A>C为主，MHP患儿以c.158G>A为主。在突变位点中c.1068C>A仅在5例cPKU患儿中检出，推测c.1068C>A可能是石家庄市cPKU中PAH基因的高频突变位点；c.331C>T、c.442-1G>A、c.611A>G、c.728G>A、c.1197A>T在各型患儿中均有检出；c.721C>T仅在3例mPKU患儿(1例为纯合突变)中检出，推测c.721C>T可能是石家庄市mPKU中PAH基因的高频突变位点；c.158G>A仅在27例MHP患儿(1例为纯合突变)中检出，推测c.158G>A可能是石家庄市MHP中PAH基因的高频突变位点。值得注意的是，c.158G>A在中国北方的mPKU和MHP患者中的突变频率似乎高于其他地区，这可能代表着某些人群的扩张或迁移[22-23]。

PAH基因突变对酶活性的影响主要依赖于突变的位置和形式，本研究发现未报道的3种PAH基因突变位点c.912+5G>T、c.61-1G>A和c.630T>G，分别位于外显子8、外显子2和外显子6。c.912+5G>T在健康人群数据库中为低频变异，根据ACMG指南[3]该变异初步判定为临床意义未明。c.630T>G位于基因的非保守区，在健康人群数据库中为低频变异，根据ACMG指南[3]该变异初步判定为临床意义未明,使用生物信息学蛋白功能综合性预测软件REVEL、SIFT、PolyPhen_2、Mutation Taster、GERP+预测结果分别为有害、良性、有害、有害、良性。c.61-1G>A位于基因的保守区，在健康人群数据库中为低频变异，根据ACMG指南[3]该变异初步判定为疑似致病性变异。这3个位点突变形式为剪接突变和错义突变，这可能会导致酶蛋白表达异常，进而影响蛋白质的折叠及稳定性，从而影响酶蛋白的催化活性。这些变化与PAHD的关系亟待进一步证实。其中发生c.912+5G>T突变的患儿为mPKU，发生c.61-1G>A和c.630T>G突变的患儿为MHP，这3个PAH基因突变位点在石家庄市mPKU和MHP患儿中检出，提示在进行mPKU和MHP患儿的确诊工作时应尤其注意这些突变位点的总结和分析，为以后石家庄市mPKU和MHP患儿PAH基因的突变类型、特点积累数据。

目前，中国已报道的PAH基因突变类型约有190余种，且大多为杂合变异类型。本研究通过分析石家庄市PAHD患儿PAH基因的突变类型、特点及与临床表型间的联系，不仅为产前诊断、遗传咨询提供了理论依据，而且对降低PAHD的发病率，提高人口素质具有重要意义。但本研究目前的数据量尚比较少，需要进一步增加标本数据进行综合分析。