饥饿胁迫对猛虾蛄溶菌酶和消化酶活性的影响

赵旺 温为庚 谭春明 黄星美 杨蕊 陈明强 杨其彬 陈旭

(1 中国水产科学研究院南海水产研究所 热带水产研究开发中心，海南三亚 572018；2 农业农村部南海渔业资源开发利用重点试验室，广东广州 510300；3 三亚热带水产研究院，海南三亚 572018)

猛虾蛄(Harpiosquillaharpax)隶属于节肢动物门、软甲纲、口足目、虾蛄科、猛虾蛄属，其生活的底质以泥底或沙泥底为主，广泛分布于印度尼西亚、马来西亚、日本、中国东南沿海等，在地中海沿岸和墨西哥湾也有分布[1-6]。猛虾蛄体形较大，可食部分较多，其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱[7]。随着人们生活水平的提高，猛虾蛄的市场需求不断增加，对其资源的开发利用变得日益重要。人工养殖是猛虾蛄产业发展的重要部分。在养殖实践中发现，猛虾蛄生长受各种环境因素的影响较大，例如，当饲养密度过大、投喂不及时、投喂不均或投饲方式改变时，猛虾蛄易受到饥饿或营养不足的胁迫，其生长性能和养殖周期也会受到影响。

研究证实，饥饿胁迫会导致鱼、虾类动物发生应激反应，影响动物的行为、存活、生长、代谢、繁殖，以及组织结构、血液常规指标、酶活性、免疫功能、肌体组成成分等，严重时可引起动物神经内分泌功能紊乱，扰乱肝胰脏生长激素、胰岛素和类胰岛素因子等的表达，诱发各种疾病，甚至导致死亡[8-13]。水生动物在受到胁迫时，为了维持生理活动，通常会通过改变自身各种酶的活性来调节代谢水平、能量分配和能源物质消耗。

目前，有关饥饿胁迫对虾类生长、体成分、消化功能、免疫功能等影响的研究已有不少报道。例如，对克氏原螯虾(Procambarusclarkii)进行短时期饥饿胁迫后，其蛋白酶活力大幅度下降[14]，克氏原螯虾仔虾消化酶的活性随着饥饿时间的延长呈现“先上升后下降”的趋势[15]，说明该虾通过降低消化酶活力来适应饥饿胁迫；南美白对虾(Penaeusvannamei)受到饥饿胁迫后，其胰蛋白酶和糜蛋白酶的活力下降了40%～60%[16]；饥饿胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)的影响主要集中在补偿生长、行为变化、营养物质消耗、生化组成、能量收支等方面[17]，可以使其体内消化酶活性呈现“先升后降”的趋势，进而影响其摄食行为[18]。溶菌酶是非特异性免疫系统的重要组成成分，其活性的变化可作为动物免疫机能状态的指标。赵朝阳等[14]研究了饥饿胁迫对克氏原螯虾部分免疫指标的影响，结果表明，饥饿胁迫对超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性具有一定影响；周凡等[19]研究发现，饥饿胁迫对莫桑比克草虾(Penaeusmonodon)幼虾免疫因子具有明显的影响。目前，有关饥饿胁迫对猛虾蛄机体酶活性影响的研究尚不多见。

为探究在饥饿胁迫下猛虾蛄体内酶活性的变化规律，本研究开展了猛虾蛄饥饿胁迫试验，测定了饥饿时长对其体内溶菌酶及常见消化酶(胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶)活性的影响，以期为研究猛虾蛄在逆境胁迫条件下的代谢调节机制提供依据，为提高猛虾蛄养殖存活率和丰富其养殖生态学理论提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用猛虾蛄购自海南省陵水黎族自治县新村渔港，共156尾，平均体质量48.39 g/尾，体长14.5～15.8 cm，体宽2.4～3.1 cm。用加水、充氧、扎口的厚尼龙袋将其运送至热带水产研究开发中心陵水基地。试验在该基地进行。

试验前，先将猛虾蛄用沙滤海水暂养7 d，其间每天分别于6：00、19：00饱食投喂新鲜的凡纳滨对虾(体质量6～10 g，剪去头胸甲和尾尖)各1次，投喂2 h后清除残饵。暂养结束后，统一停止投喂。

养殖过程中，水温为(26.5±1.0)℃，pH为8.0±0.2，盐度为33.0±0.6，溶解氧在6.8 mg/L以上，氨氮含量低于0.01 mg/L，亚硝酸盐含量低于0.03 mg/L。每日换水1次，每次换水50%。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

选取经过暂养、健康无病的猛虾蛄120尾，随机分放于60口水泥池(长100 cm、宽100 cm、水深100 cm)中，每口试验池投放2尾。试验期间，池内连续充气，不投饲，其他饲养条件与暂养时相同。分别于试验第1、6、11、21天(记为饥饿胁迫0、5、10和20 d)取样，每次随机取5～10尾，如发现有猛虾蛄死亡，则该池作废。取样时，先剪掉虾的掠足，并用滤纸吸干水分。用1 mL注射器从靠近虾尾节处斜插入围心管，抽取血液于离心管中。剪开虾背部甲壳，从尾部宽阔部位剪取肌肉0.5 g，分离出肠道和肝胰脏，分别置于离心管中。所有操作在冰面进行，样品置于-20 ℃保存。

1.2.2 样品处理

将各组所采集的肠道、肝胰腺、肌肉样品称量后，按质量和体积比1∶2与0.2 mol/L生理盐水进行混合、研磨。研磨液于4 ℃、4 000 r/min下离心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。分别测定血液和肌肉样品的总蛋白和溶菌酶活性指标；分别测定肠道、肝胰腺的总蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性指标。总蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性指标分别按照相关试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号分别为A045-4-2、A050-1-1、A080-1、A054-1-1、C016-1-1)的步骤进行测定，酶活力按照各说明书指标进行计算。每组样品平行测定3次。

1.2.3 数据处理

试验数据以“平均值±标准差”表示。数据经EXCEL 2010软件初步整理后，用SPSS 21.0软件进行统计分析。先对数据作单因素方差分析(one-way ANOVA)，若处理间有显著差异，再用Duncan法比较均值间的差异显著性，设显著性水平为0.05。

2 结果

2.1 饥饿胁迫对猛虾蛄溶菌酶活性的影响

饥饿胁迫对猛虾蛄溶菌酶(LZ)活性的影响见图1。结果显示，饥饿时长对猛虾蛄各组织中溶菌酶的活性影响显著(P<0.05)。各组样品的溶菌酶活性均随着饥饿时间的延长呈现先升后降的变化趋势。饥饿胁迫10 d，猛虾蛄血液、肠道、肝胰腺和肌肉组织溶菌酶的活性与未经饥饿胁迫(0 d)相比分别从56.30、169.45、101.74、104.74 U/mg提高到117.89、322.86、152.57和174.69 U/mg。之后，随着饥饿时间的延长，各组溶菌酶活力均有所下降。

注：无相同字母表示组内数据差异显著(P<0.05)，下同。

2.2 饥饿胁迫对猛虾蛄胃蛋白酶活性的影响

饥饿胁迫对猛虾蛄胃蛋白酶活性的影响见图2。总体上，饥饿胁迫时长对猛虾蛄胃蛋白酶的活性影响明显(P<0.05)，但不同组织中胃蛋白酶的活性随时长的变化不一致。其中，肠道中胃蛋白酶活性在饥饿胁迫5 d时略有下降，之后，随着饥饿时间的延长不断上升，并在饥饿胁迫20 d时达到3.34 U/mg；而肝胰腺中胃蛋白酶的活性则在饥饿胁迫5 d后呈现先降后升的变化趋势，饥饿胁迫5～10 d，胃蛋白酶活性呈现下降趋势，10 d后开始呈现逐步上升趋势。

图2 饥饿胁迫时长对猛虾蛄胃蛋白酶活性的影响

2.3 饥饿胁迫对猛虾蛄脂肪酶活性的影响

饥饿胁迫对猛虾蛄脂肪酶活性的影响见图3。试验结果显示，饥饿胁迫时长对猛虾蛄肠道和肝胰腺中的脂肪酶活性影响显著(P<0.05)。肠道中的脂肪酶活性随着饥饿时间的延长呈现先升后降的变化趋势，而且波动幅度较大，饥饿胁迫5 d时，肠道中的脂肪酶活性最高，达293.54 U/g，但在20 d时降低至114.05 U/g；而肝胰腺中脂肪酶的活性在饥饿胁迫0～5 d变化较小，5～10 d出现大幅度上升，10 d后又略有下降。

图3 饥饿胁迫时长对猛虾蛄脂肪酶活性的影响

2.4 饥饿胁迫对猛虾蛄淀粉酶活性的影响

饥饿胁迫对猛虾蛄淀粉酶活性的影响见图4。结果显示，饥饿时长对猛虾蛄淀粉酶的活性影响显著(P<0.05)。猛虾蛄肠道淀粉酶的活性随着饥饿时间的延长呈现先升后降的变化趋势，在饥饿胁迫5 d时，淀粉酶活性达到最高(4.28 U/mg)，之后开始下降，并在20 d时降至最低(2.12 U/mg)；而肝胰腺淀粉酶的活性则随着饥饿时间的延长呈现先降后升的变化趋势。

图4 饥饿胁迫时长对猛虾蛄淀粉酶活性的影响

3 讨论

外部环境的改变会导致水生动物机体消化和免疫相关酶类的活性发生变化，进而影响其摄食、生长和健康[20-21]。水生动物在饥饿状态时，主要通过改变身体各种酶的活性来调节代谢水平、能量分配和能源物质消耗，以适应食物缺乏造成的胁迫，维持机体生理活动。Pedersen等[22]指出，大西洋鲱(Clupeaharengus)仔鱼体内胰蛋白酶及酶原含量的变化与食物数量有关，鱼类的摄食种类和数量受体内消化酶分泌及其活性的影响。

本试验发现，饥饿时长对猛虾蛄血液、肠道、肝胰腺和肌肉组织中溶菌酶的活性有显著影响(P<0.05)。各组织中的溶菌酶活性均随着饥饿时间的延长呈现先升高后降低的变化规律。这说明当猛虾蛄受到一定时间的饥饿胁迫后，其体内的溶菌酶会被刺激而升高，但当胁迫时长超过其适应范围时，溶菌酶活性便会下降。这与周元雪[23]关于饥饿胁迫对口虾蛄免疫因子影响的研究结果相似，即短期(5 d)饥饿胁迫可激活口虾蛄溶菌酶的活性，而长期(25 d)饥饿胁迫会使口虾蛄溶菌酶的活性降低，总体上，溶菌酶活性随着饥饿时长增加呈先升后降的趋势。本试验中，在饥饿胁迫5 d时，各组织溶菌酶活性变化均不大，说明猛虾蛄具有面对饥饿胁迫的应激适应机制，即在饥饿初期，机体可以通过免疫机能来适应外部环境的变化，进行自我保护[24]。在整个饥饿胁迫阶段，溶菌酶的活性呈现先升高后降低的趋势，在饥饿胁迫10 d时达到最高值，说明随着饥饿时间的延长，猛虾蛄长时间未获得外源性营养物质，其免疫抗病机能下降了[23]。

在研究饥饿胁迫对猛虾蛄胃蛋白酶活性的影响时发现，饥饿胁迫对猛虾蛄各组织胃蛋白酶的活性影响显著(P<0.05)，但各组织中胃蛋白酶活性的变化趋势不一致。肠道中胃蛋白酶的活性随着饥饿时间的延长，在饥饿胁迫5 d时略有下降，之后不断上升，在饥饿胁迫20 d时达到最高值3.34 U/mg。这可能是胃黏膜的通透性发生了改变所致[25]。在饥饿胁迫5 d时，猛虾蛄肠道胃蛋白酶的活性有所下降，之后不断上升，说明饥饿胁迫可以促进肠道胃蛋白酶的分泌并激发其活性。谷江稳[26]在研究饥饿胁迫对银鲳幼鱼消化系统的影响时指出，在饥饿过程中，各消化器官的胃蛋白酶活性均呈现先下降后上升的变化趋势，这与本文的研究结果相一致。但也有研究报道，随着饥饿胁迫时间的延长，动物体内胃蛋白酶活力呈现先升后降的变化，可能是饥饿时间过长，机体的应激适应能力下降所致[18，27]。肝胰腺中的胃蛋白酶活性呈现先降后升的变化趋势，肝胰腺中胃蛋白酶活性下降可能是由于饥饿胁迫影响了猛虾蛄肝胰腺组织结构导致的[28]，随着饥饿胁迫时间的延长，猛虾蛄长时间无法摄取外源性营养物质，其肝胰腺胃蛋白酶的活性开始提高，可能是肝胰腺开始消耗有机物质，为机体提供能量[29]。

饥饿胁迫对猛虾蛄脂肪酶活性影响的结果表明，饥饿时长对猛虾蛄各组织脂肪酶活性影响显著(P<0.05)。其中，肝胰腺脂肪酶的活性在饥饿胁迫0～5 d变化较小，5～10 d出现大幅度上升，10 d后又略有下降。这是因为在较长时间的饥饿胁迫下，机体可通过促进淀粉酶分泌提高其活性来利用体内储存的脂肪作为能源物质[27]，之后机体尽可能将代谢保持在一定水平之上，以保证在重新获取食物或面临其他的环境胁迫时能承受相应的应激反应[17，30]。肠道中脂肪酶的活性随着饥饿时间的延长呈现先升后降的变化趋势，而且波动幅度较大，饥饿胁迫5 d时，肠道脂肪酶活性达到最高，在20 d时又降至最低。这说明肠道对饥饿胁迫比其他组织更为敏感，在饥饿胁迫后期，肠道长时间没有受到食物蠕动的机械刺激，导致消化酶液的分泌量下降[15，31]。

本试验结果显示，饥饿时间对猛虾蛄淀粉酶活性影响显著(P<0.05)。随着饥饿胁迫时间的延长，肝胰腺淀粉酶的活性呈现先降后升的趋势，并在饥饿胁迫20 d时达到最高；而肠道淀粉酶活性呈现先升后降的趋势，在饥饿胁迫5 d时达到最高(4.28 U/mg)，之后开始下降，并在20 d时降至最低(2.12 U/mg)。这表明肠道内的淀粉酶活性发生了与饥饿胁迫相适应的变化，并且短期饥饿对猛虾蛄造成的氧化应激损伤可逆[27，32]。试验期间，肠道内的淀粉酶活性与脂肪酶活性变化趋势一致，这说明在受到饥饿胁迫时，猛虾蛄体内的脂肪酶活性和淀粉酶活性同时受到调节[33]。试验期间，肝胰腺淀粉酶活性的变化趋势与上述趋势相反。这可能是因为饥饿胁迫对各组织的影响程度不同，消化道部位黏膜层上皮短时间内不会受到太大的损伤，而肝细胞、腺泡细胞短时间内便会出现萎缩和排列不规则等现象[34]。

猛虾蛄作为中国东南沿海分布广泛的海产品和具有巨大开发潜力的虾蛄品种[35]，对其生长性能的深入研究和养殖技术的提高迫在眉睫。本文所探讨的饥饿胁迫对动物生长、代谢、组织结构、血液常规指标、酶活性和免疫功能等都有影响。研究发现，饥饿初期猛虾蛄体内溶菌酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性均有所上升，但是随着胁迫时间的延长，各组织溶菌酶和消化酶活性出现不同程度的下降。这可能是猛虾蛄具有面对饥饿胁迫的应激适应机制。饥饿初期，机体可以通过免疫机能来适应外部环境的变化，进行自我保护，并且短时间饥饿对猛虾蛄造成的氧化应激损伤可逆，但在长时间的饥饿胁迫下，机体的应激适应能力和免疫抗病能力下降；同时，在长期饥饿胁迫下，猛虾蛄可通过促进脂肪酶和淀粉酶的分泌并激发其活性来利用体内储存的能源物质，以维持生理活动。本研究对猛虾蛄的养殖和投饲具有实用意义，猛虾蛄个体溶菌酶和消化酶活性的变化也充实了饥饿胁迫对其应激试验免疫和消化性能层面的基础数据，可为其他水产动物饥饿胁迫试验提供数据基础和科学依据。

4 结论

本研究结果显示，养殖过程中饥饿胁迫时长对猛虾蛄溶菌酶和各消化酶活力均有一定影响。猛虾蛄体内血液、肠道、肝胰腺和肌肉组织溶菌酶的活性均随着饥饿胁迫时间延长呈现先升后降的变化趋势；同时，肠道和肝胰腺中的胃蛋白酶和脂肪酶的活性随着饥饿胁迫时长具有相似的变化趋势，但存在显著性差异(P<0.05)；肝胰腺和肠道中的淀粉酶活性则呈相反的变化趋势。研究表明，在饥饿胁迫期间，猛虾蛄可改变机体溶菌酶及消化酶的活性来维持生长和代谢。