基于Cytb基因的滆湖鲌类国家级水产种质资源保护区3种鲌鱼的遗传多样性分析

李大命 刘洋 唐晟凯 刘燕山 蔡永久 谷先坤 殷稼雯 蒋琦辰 张彤晴

(1 江苏省淡水水产研究所，江苏省内陆水域渔业资源重点实验室，江苏南京 210017；2 南京师范大学海洋科学与工程学院，江苏南京 210046； 3 中国科学院南京地理与湖泊研究所，湖泊与环境国家重点实验室，江苏南京 210008)

翘嘴鲌(Culteralburnus)、达氏鲌(Culterdabryi)、蒙古鲌(Cultermongolicus)均隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科( Cyprinidae)，鲌亚科(Culterinae)，鲌属(Culter)[1]。鲌鱼在我国分布广泛，是内陆水域中重要的经济鱼类，在很多湖泊及水库中的渔获量较大[2-4]。鲌鱼肉质细嫩、味道鲜美，富含多种氨基酸，具有较高的营养价值[5]。作为湖泊和水库生态系统中主要的顶级消费者，鲌鱼的种群变动对于鱼类及其他生物群落都具有重要影响，在水生态系统中具有重要的生态价值[6-7]。近年来，由于过度捕捞、栖息地改变、水质污染等人为因素影响，鲌鱼天然资源急剧衰退，并呈现出低龄化、小型化的趋势，保护鲌鱼种质资源刻不容缓[8-10]。

国家级水产种质资源保护区是为了实现水产种质资源及其生存环境的保护和合理利用，依法予以特殊保护和管理的水产种质资源主要生长繁殖区域。滆湖鲌类国家级水产种质资源保护区位于江苏省常州市武进区西南处滆湖水域的北端，保护区面积为1 520 hm2，其中核心区面积509 hm2，实验区面积1 011 hm2，保护期为全年，主要保护对象为翘嘴鲌、蒙古鲌及达氏鲌。多年来，受气候变化、过度捕捞、环境污染、工程建设等因素的影响，水产种质资源保护区的保护对象生存受到巨大威胁，同时，对其遗传状况也缺乏了解[11]。

遗传多样性是评价物种资源状况的1个重要指标，也是物种适应周围环境变化、维持生存和进化的基础，研究物种的遗传多样性对于评估物种资源现状、制定野生种群保护策略以及合理利用种质资源等方面具有重要意义[12-13]。鱼类的线粒体基因组是1种双链DNA分子，具有分子小、结构简单、编码效率高、母系遗传、重组率低、进化速率快等特点，已成为群体遗传学和系统学研究的重要分子标记[14-15]。细胞色素b(cytochromeb,Cytb)基因长度适宜，进化速度适中，有通用引物便于扩增，因而是研究鱼类遗传变异的良好的分子标记[16-18]。本研究采用Cytb基因序列，首次对滆湖鲌类国家级水产种质资源保护区主要保护对象的遗传多样性和遗传结构进行了研究，研究结果一方面用于评估保护区对象的种质资源现状，另一方面可为鱼类种质资源的科学保护及合理利用提供基础资料及参考依据。

1 材料和方法

1.1 鱼类样品采集和处理

2019年7月至11月和2020年5月、9月，在滆湖鲌类国家级水产种质资源保护区开展渔业资源调查。利用3层刺网采集鱼类样本，刺网网长125 m，网高1.5 m，网目长度为2～14 cm。鱼类种类鉴定依据《江苏鱼类志》[2]，共采集翘嘴鲌25尾，蒙古鲌18尾，达氏鲌50尾。现场剪取样本的肌肉组织，置于无水乙醇中保存。

1.2 DNA提取、PCR扩增和测序

采用TakaraBio公司的广谱性基因组试剂盒提取鱼类肌肉组织的基因组DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳检验DNA完整性，并利用紫外分光光度计测定DNA浓度。

利用通用引物L14724和H15915[19]扩增Cytb基因序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增体系为50 μL，其中Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 2 μL，剩余体积用超纯水补足。PCR程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检验，将条带清晰的扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

1.3 序列分析

利用BioEdit 7.0软件[20]读取序列，进行编辑和比对，并辅以人工校正。利用DnaSP 5.0软件[21]分析序列的变异位点、简约信息位点、单一信息位点，计算单倍型数、单倍型多样性(haplotype diversity,h)、核苷酸多样性(nucleotide diversity,π)以及平均核苷酸差异数(K)。使用MEGA 6.0软件[22]计算序列的碱基组成、种群内及种群间的遗传距离，以鲤为外类群，选用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建鲌鱼的单倍型系统发育树。采用Arlequin 3.11软件[23]进行Tajima’sD和Fu’sFs中性检验，并开展核苷酸不配对分布检测，进行种群动态分析。

2 结果

2.1 线粒体Cytb基因序列碱基组成

经分析和比对，获得3种鲌鱼的线粒体Cytb基因全序列，其全长为1 141 bp，所有序列均无碱基插入或缺失。3种鲌鱼的碱基组成相似，种类之间差异很小。3种鲌鱼碱基A、T、C、G的平均含量分别为28.9%、27.5%、28.8%和14.8%，A+T的含量(56.4%)高于G+C的含量(43.6%)，表现出明显的碱基组成偏向性。A+T含量的排列顺序由高到低依次为达氏鲌(56.8%)、蒙古鲌(56.4%)和翘嘴鲌(56.0%)(见表1)。

表1 3种鲌鱼线粒体Cytb基因序列的碱基组成

2.2 遗传多样性和单倍型组成

翘嘴鲌的线粒体Cytb基因序列有16个变异位点，其中9个单一信息位点，7个简约信息位点，单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(π)分别为0.907和0.002 4；蒙古鲌Cytb基因序列有8个变异位点，全部是简约信息位点，其单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(π)分别为0.863和0.002 4；达氏鲌Cytb基因序列有10个变异位点，其中3个单一信息位点，7个简约信息位点，其单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(π)分别为0.573和0.001 2(见表2)。单倍型多样性(h)从高到低依次为翘嘴鲌、蒙古鲌和达氏鲌，核苷酸多样性(π)从高到低依次为蒙古鲌、翘嘴鲌和达氏鲌。

表2 3种鲌鱼线粒体Cytb基因的遗传多样性参数

翘嘴鲌群体由14种单倍型(QH1～QH14)组成，单倍型QH2的数量最多，有10个样本，QH4和QH8各有2个样本，其余单倍型各有1个样本；蒙古鲌群体由6种单倍型(MH1～MH6)组成，单倍型MH1的数量最多，有10个个体，单倍型MH2、MH3和MH4各有2个个体，单倍型MH5和MH6各有1个个体；达氏鲌群体由7种单倍型(DH1～DH7)组成，单倍型DH1的数量最多，有31个个体，单倍型DH6有11个个体，单倍型DH3、DH5和DH7各有2个个体，其余单倍型各有1个个体(见表2)。

2.3 遗传距离

3种鲌鱼的种内遗传距离显示(见表3)，达氏鲌、翘嘴鲌和蒙古鲌群体内的平均遗传距离分别为0.001、0.002和0.002。3种鲌鱼群体间的遗传距离为0.053～0.072，其中翘嘴鲌和蒙古鲌间的遗传距离最大，翘嘴鲌和达氏鲌间的遗传距离最小。

表3 3种鲌鱼的群体内(对角线)及群体间(下三角)遗传距离

以鲤为外类群，基于邻接法(NJ)构建3种鲌鱼的单倍型系统进化树(见图1)。结果显示，3种鲌鱼均形成独立的进化分支，分支置信限水平均为100%，鲤单独聚为一支，说明Cytb基因是区分和鉴别3种鲌鱼的有效分子标记。

图1 基于邻接法的3种鲌鱼系统发育树

2.4 种群进化历史

对3种鲌鱼进行Tajima’sD和Fu’sFs中性检验，结果显示(见表4)，中性检验的D值和Fs值均为负值，且翘嘴鲌Fs值统计检验结果具有显著性(P<0.05)，说明3种鲌鱼在进化过程中偏离了中性选择。另外，3种鲌鱼的歧点分布图(见图2)呈较明显的单峰型，结合中性检验结果，表明3种鲌鱼在历史上经历了种群扩张。

表4 3种鲌鱼的中性检验结果

图2 3种鲌鱼Cytb基因序列错配碱基分布

3 讨论

3.1 3种鲌鱼的遗传多样性

遗传多样性是生物多样性的基础，也是评价生物种质资源状况及制定种质资源保护措施的重要依据。通常选用单倍型多样性(h)及核苷酸多样性(π)两个参数用于评价群体的遗传多样性水平，h和π值越大，表示群体的遗传多样性越丰富[24-25]。本研究结果显示，滆湖鲌类保护区3种鲌鱼的单倍型多样性为0.573～0.907，核苷酸多样性0.001 2～0.002 4，其中翘嘴鲌和蒙古鲌的遗传多样性水平较高，达氏鲌的遗传多样性水平较低，说明保护区内3种鲌鱼的遗传多样性存在较大差异。同样，其他水域不同种类的鲌鱼群体遗传多样也有明显差异[26-28]。基于COI序列的三峡库区翘嘴鲌群体的单倍型和核苷酸多样性分别为0～0.990 5和0～0.014 1，蒙古鲌群体的单倍型和核苷酸多样性分别为0.866 7～1.0和0.002 2～0.002 4，达氏鲌群体的单倍型和核苷酸多样性分别为0～1和0～0.071 5[26]；基于COI序列的长江中下游5个达氏鲌群体的单倍型和核苷酸多样性分别为0.412 3(0～0.600)和0.001 1(0～0.001 5)[27]，5个蒙古鲌群体的单倍型和核苷酸多样性分别为0.664(0～0.800)和0.002(0～0.003)[28]。根据Grant和Bowrn[29]提出的鱼类遗传多样性大小标准，即单倍型多样性和核苷酸多样性分别以0.5和0.005为界值，本研究中3种鲌鱼的遗传多样性呈现出高单倍型多样性和低核苷酸多样性的模式，这种遗传多样性模式是鱼类受瓶颈效应后种群数量迅速扩张导致的。由于核苷酸多样性所需的时间比积累单倍型所需的时间漫长，因而形成高单倍型多样性和低核苷酸多样性的特征。另外，这种遗传多样性模式暗示，3种鲌鱼群体在进化历史上经历过群体扩张事件。3种鲌鱼的中性检验结果显示，Tajima’sD值和Fu’sFs值均为负值，且翘嘴鲌统计检验结果具有显著性，同时，3种鲌鱼的歧点分布图呈现较明显的单峰型，表明3种鲌鱼在进化历史上经历过种群扩张过程[30-32]，与其遗传多样性模式相对应。

3.2 3种鲌鱼的遗传结构

研究表明，基于mtDNA序列的鱼类种内遗传变异在10%以内[33]。Hebert等[34]基于COI序列对动物间的遗传变异进行研究，结果表明，种内遗传距离大多在2%以下，种间遗传距离比种内遗传距离大10倍以上。本研究结果显示，3种鲌鱼的种内遗传距离在0～0.006，种内遗传变异远小于2%，表明3种鲌鱼的种内遗传变异较小。这是因为保护区面积相对较小，没有地理隔离限制，3个群体的种内个体间具有广泛的基因交流。从群体的遗传组成来看，群体的遗传结构趋于单一化，单个单倍型占群体的比例较高。比如，翘嘴鲌由14种单倍型组成，单倍型QH2有10个，占比为40.0%；蒙古鲌由6种单倍型组成，单倍型MH1有10个，占比为55.6%；达氏鲌由7种单倍型组成，单倍型DH1的数量为31个，占比高达62.0%。可能是因为3种鲌鱼的有效群体数量较小，导致遗传结构受遗传漂变的影响较大，因而形成单一化的遗传结构模式[35]。

3.3 种质资源管理和保护建议

鲌鱼具有重要的经济价值、营养价值和生态价值，但近年来，其种群资源量急剧下降，并呈现出小型化、低龄化的趋势。本研究结果显示，保护区3种鲌鱼的单倍型多样性较高，而核苷酸多样性较低，遗传结构趋于单一化。结合滆湖生态环境和鲌鱼的生物学特征，需要采取针对性措施恢复鲌鱼资源，提高鲌鱼群体的遗传多样性水平。建议：(1)开展鲌鱼增殖放流，增加鱼类种群数量，优化鱼类遗传结构；(2) 控制滆湖环境污染，治理蓝藻水华，改善鱼类栖息环境；(3)建设人工鱼巢，构建水域生态牧场，增加鲌鱼产卵和孵化的基质和空间；(4)严格渔业执法，严厉打击非法捕捞行为，保护鱼类繁殖和生长。