牙龈卟啉单胞菌快速诊断方法研究进展

2022-02-10韩海芳李智涛郑月月梁梦歌高社干

食管疾病 2022年4期

韩海芳，李智涛，郑月月，梁梦歌，王烁，高社干,2

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)属于革兰氏阴性球杆菌，在血平板上培养可与亚铁血红素结合形成黑色菌落，表面似金属光泽，完全溶血。Pg有蛋白水解酶活性，分解色氨酸产生吲哚，无尿素酶和过氧化氢酶活性。Pg的毒力因子包括牙龈蛋白酶、荚膜、菌毛、血凝素、脂多糖、溶血素和铁摄取转运蛋白等，在细菌黏附和侵袭宿主细胞的过程中起着关键作用[1]。补体系统的失调、抗菌肽的降解和吞噬细胞功能的破坏能够促进Pg的生存并导致其持续存在。Pg是牙周炎的主要病原体，能够通过破坏牙齿周围组织导致炎症性疾病，最终可能导致牙齿脱落[2]。另外，Pg还与多种系统性疾病有关，如糖尿病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、阿尔兹海默病和帕金森病等[3-4]。目前，已有大量文献报道Pg与口腔及消化道癌症也有一定的相关性，Pg可以促进食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的进展。这些由Pg引起的疾病威胁着人类的健康，给社会带来了巨大的压力，建立Pg的快速临床检测方法显得至关重要。本文将主要从细菌学、免疫学、分子生物学以及新兴技术等方面，对当前多种Pg检测相关的研究进行综述。

1 细菌学常规检测方法

1.1 分离培养法

细菌检测常用的方法为培养法，包括固体、液体和半固体培养等。根据不同种类细菌的生长要求，需要严格控制温度、酸碱度、营养、厌氧环境等条件。Pg生长需要较高的营养条件，需要厌氧培养法来鉴定识别，在培养基中还需要添加氯化血红素以及维生素K。使用固体培养基培养3 d后Pg可形成直径约0.5～1.0 mm的白色菌落，突起于培养基表面，质硬且与培养基表面黏附较紧，7 d后菌落由白色变成黑色。

口腔中有大量的细菌，也可以采用共培养法培养多种细菌。从慢性牙周炎患者的龈下菌斑样本中培养口腔细菌，在血琼脂平板上生长的菌落表现出以下特征：Pg为微小的黑色、圆形、溶血性菌落；中间普氏菌呈褐色至黑色色素沉着、潮湿、不溶血的菌落；具核梭杆菌是微小的灰色、面包屑状菌落；福赛斯坦纳菌是微小的褐色、半透明和潮湿的菌落[5]。说明共培养方法可用于从口腔菌群中分离Pg。

培养细菌后可借助仪器观察Pg更细微的形态结构，用药后观察Pg菌体情况。将Pg(ATCC 33277)实验菌株接种于BHI血琼脂平板上，37 ℃厌氧培养48 h后观察，Pg正常形态为边缘光滑呈球杆状，随着黄芩质量的增加，Pg形态出现不规则变化，甚至出现菌体崩解现象[6]。肖晓蓉[7]在BHI培养基上研究了对氨基苯甲酸对Pg形态的影响，发现100 mg.L-1对氨基苯甲酸对Pg菌体影响较大，普遍出现明显的变形，呈凹陷状和不规则状甚至崩解。可见，传统的细菌分离培养方法在临床细菌鉴定中具有不可或缺的重要作用，但检测时间太长，很难达到快速鉴定的目标。

1.2 染色法

革兰氏染色使用结晶紫或亚甲蓝作为主要颜色，是微生物学中最重要的染色技术之一。根据革兰氏染色和形态学差异，细菌可分为革兰氏阳性球杆菌和革兰氏阴性球杆菌。革兰氏阴性细菌不吸收初级染色，因此在显微镜下呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。Pg属于革兰氏阴性杆菌。Noiri Y[8]为了研究Pg、直肠弯曲杆菌和黏稠放线菌的分布，取牙周炎周围的牙周组织加工成连续切片，用 Brown & Brenn 修饰的革兰氏染色法染色观察到Pg主要存在于牙菌斑区域，特别是在浅袋和中袋区。革兰染色也存在假阴性和假阳性。当然，染色步骤也在发生改进，目前有四步法、三步法和两步法，但是，革兰氏染色法仍然是目前临床细菌学检验中最常用的检测方法之一。

苏木素伊红染色法(HE染色法)是病理组织切片中使用最多的一种常规染色方法。碱性的苏木素染液主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色，酸性染料伊红主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色[9]。通过HE染色，发现Pg会导致组织发生炎症反应。将Pg长期微量注入糖尿病大鼠肝脏，取肝脏组织切片，HE染色观察组织病理学变化，发现Pg缓慢入血后肝脏内高迁移率族蛋白l表达异常升高，提示出现慢性炎症反应[10]。为了诱导软组织炎症，在CD14 缺陷小鼠和正常小鼠局部注射牙龈卟啉单胞菌脂多糖，用HE染色软组织后，测量奶酪样坏死组织的表面积和淋巴细胞、中性粒细胞的数量，得出LPS脂多糖可与CD14受体结合，并诱导炎性细胞因子的表达[11]。虽然HE染色应用广泛，但仍存在一定的局限性，染色结果易受温度、时间、固定和脱水等因素的影响。

2 免疫学检测方法

2.1 免疫酶测定法

2.1.1 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)ELISA是一种根据抗原抗体反应从而达到检测目的，以高特异性和高灵敏度为特点的检测生物分子的免疫学方法[12]。有直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法。直接法是将抗原或者抗体固定在载体上后加入抗体或者抗原最终形成抗原—抗体复合物，再加入底物显色。间接法是将抗原固定在固相载体上，先加入待测抗体，后加入酶标抗体来实现对待测抗体的检测。双抗体夹心法是将抗体连接在固相载体上，洗涤后加入待测抗原，再加入酶标抗体，但抗原必须有两个可结合部位，最后形成三明治结构[13]。竞争法是将特异性抗原致敏在载体上，加入待测抗体与酶标抗体进行竞争结合，经过孵育洗涤后加入底物显色，待测抗体量与显色深浅成反比。研究显示：将Pg的牙龈蛋白酶制备单克隆抗体，通过ELISA测定法检测Pg，测试结果与其它口腔细菌无交叉反应[14]，说明ELISA检测方法可以用于检测唾液中Pg。虽然ELISA方法不需要特别昂贵的试剂，但是操作时间较久，需要5 h左右，步骤也较繁琐。

2.1.2 生物素亲和素酶联免疫吸附试验(biotinavidin system-enzyme linked immunosorbent assay,BAS-ELISA)BAS-ELISA是一种广泛应用的免疫酶放大系统，可应用到视觉膜免疫分析技术中，是用抗体检测分析物并在膜上产生视觉可读的灵敏且快速的检测方法。把Pg的RgpB抗体预包被在硝酸纤维素膜上，捕获Pg后加入生物素化的Kgp抗体，分析物被膜包被抗体和生物素化抗体以夹心形式捕获。将生物素化抗体与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)结合，用 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)底物显色后出现蓝色[15]。该技术不需要检测设备，因为它可以用肉眼观察，因此可用于制造经济、快速的Pg检测试剂盒。

2.1.3 免疫组化检测法免疫组化是利用已知的特异性抗体与组织或细胞内的抗原结合,并利用酶作用于底物将所产生的颜色反应对抗原定位、定性、定量检测的一种技术。目前已成为常规的病理学检测技术，为病理诊断提供可靠的诊断依据。已有证据表明食管癌的发生和预后与Pg有显著关系，可以通过免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase,SP)检测ESCC组织中的Pg。我国学者马立宇[16]采用免疫组织化SP法对ESCC患者的癌组织和癌旁组织进行染色，然后分析Pg蛋白表达，该方法在ESCC诊断及预后评估中有极高的应用价值。

2.2 免疫印迹检测法(western blotting,WB)

WB已被广泛应用于医学研究领域，通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺(Sodium dodecyl sulfate polyAcrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶电泳将不同分子量的蛋白分离开来，然后再转移到聚偏二氟乙烯(poiy vinylidene fluoride,PVDF)膜上，再用特异的单克隆抗体与蛋白质发生反应，从而对蛋白质进行定性及定量分析。为了检测Pg菌毛蛋白(抗原)，可用Pg的单克隆抗体作为一抗，然后使用酶标二抗来检测Pg单抗。另外，WB在Pg致病机制的研究中也扮演了重要角色，如将Pg注射到SD大鼠的尾静脉，通过WB检测海马组织Tau蛋白的表达水平得出Pg可以使Tau蛋白过磷酸化，并促进炎症的发生[17]。虽然WB方法对研究Pg至关重要，但是WB的实验结果往往受制胶、上样、转膜和温度等多方面影响。

2.3 免疫荧光检测法

免疫荧光是用异硫氰酸荧光素或藻红蛋白这两种常用的荧光素来标记一抗或二抗，去检测特异的抗原或抗体的方法，有直接荧光法和间接荧光法。研究显示：在检测Pg方面，间接免疫荧光比DNA探针和细菌培养检测方法更加敏感[18]。另外，免疫荧光检测法也可与流式细胞术(fluorescene-activated cell sorting,FACS)结合，使用针对Pg特异性脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)的单克隆抗体和异硫氰酸荧光素标记的二抗，通过FACS鉴定Pg，为快速筛选斑块样品中的细菌提供了新方法[19]。

2.4 免疫层析检测法

免疫层析检测法是临床免疫学检验常用的方法之一。将抗体或抗原致敏在硝酸纤维素膜上，待测抗原或抗体通过毛细管作用与之发生反应，在免疫胶体金影响下产生颜色。该方法可用于检测病毒、细菌、支原体和衣原体等。在检测Pg方面，可用Pg的FimA蛋白制备单克隆抗体，分别把结合不同抗原位点的单抗作为金标抗体和捕获抗体检测Pg。该方法可以通过肉眼观察结果，大大缩短了检测的时间，成本低，适合临床上大批量样本检测。

2.5 免疫磁珠分选法

随着科技的进步，免疫学识别方式也越来越多样化。免疫磁珠分选法是一个很好的选择，不仅可以用来分选细胞，还可以结合抗体去检测细菌。许多学者通过免疫磁珠分离法对Pg进行了大量的研究，例如：裴振华[20]将特异性抗体结合在免疫学磁珠上捕获和分离Pg，通过观察免疫磁分离前和分离后检测样本的阻抗变化来实现Pg特异性检测。

3 分子生物学检测方法

3.1 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)

PCR是一种扩增特定DNA片段的分子生物学技术，具有非常高灵敏度和特异性[21]。研究显示：采用 PCR检测方法检测龈下菌斑中的Pg，其检出率与牙周破坏的严重程度呈正相关[22]。不同的Pg菌株可能引起不同程度的牙周病。Kulkarni MR[23]使用异源双链PCR来检测不同严重程度的牙周炎病变中发现了Pg菌株的多样性，PCR为分析Pg菌株多样性提供了一种简单准确的检测方法。然而，当研究人类动脉粥样硬化钙化样本时，Pg的 16SrRNA基因特定片段的扩增结果不佳，采用嵌套式 PCR 的方案可将Pg的检测率提高了22.2%，具有良好的特异性[24]。PCR扩增往往存在假阴性、假阳性和非特异性扩增等问题，但是可以通过优化反应体系中各种参数和优化扩增条件来提高PCR方法的敏感性和特异性。

3.2 荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)

qPCR技术具有操作简便、灵敏度高和特异性强等特点，在医学、生物学和病理学等领域均有广泛的应用[25]。很多学者用qPCR来检测Pg，例如Gu BL[26]使用Tris-EDTA缓冲液处理样品后直接 qPCR(TE-direct qPCR)进行测试，并与常规PCR进行对比，结果显示 TE-direct qPCR 检测是一种简单有效的口腔Pg定量方法，并且显示出较高的灵敏度和特异性。另外，研究显示qPCR比PCR能更加敏感地检测出牙周病患者Pg的16S rRNA[27]。可见，qPCR 是一种灵敏特异的 DNA 扩增技术，在检测Pg方面具有良好的应用前景。

3.3 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

LAMP是一种用于检测目标 DNA 和 RNA 的通用技术，可使用最少的设备进行快速分子诊断。LAMP需要4种引物和1种DNA聚合酶在等温条件下高效率和高特异性地进行扩增。LAMP检测技术已经应用于临床牙周病原体的检测，特别是Pg的快速检测，其检测结果与常规PCR检测的结果基本一致[28]。随后，分子信标-Loop介导的等温扩增，被称为MB-LAMP，用于检测特定DNA片段的Pg。这种方法为Pg的即时检测提供了巨大的便利。MB-LAMP 的检测速度明显快于qPCR，减少了临床诊断所需的时间[29]。

4 其它新兴技术

4.1 纳米技术检测

纳米技术是一场新的技术革命，具有高性能、多功能、缩微化、成本低和环境友好等特点，该技术推动了生物化学、微电子技术、物理化学和材料学等多个领域的发展[30]。纳米技术与免疫学技术相结合加快了细菌检测的速度与灵敏度。牙龈蛋白酶(gingipain)是Pg特异性蛋白酶，将牙龈蛋白酶特异性肽底物标记磁性纳米珠，金色变成黑色，当样品中有Pg时金色再次出现，由此对Pg进行快速检测[31]。邸小建[32]通过溶胶凝胶法制备上述转换荧光纳米微球，经表面改性后结合Pg抗体，用直接免疫法与Pg进行反应，结果显示结合抗体的纳米颗粒能够与Pg特异性地结合，提示该方法是一种潜在的Pg检测方法。

4.2 表面增强拉曼光谱( surface-enhanced raman scattering ,SERS)检测

SERS是一种能将待测目标物的信号强烈放大的技术。纳米结构通常由SERS活性金属制成，例如银、金、铜或它们的合金。原因是它们具有覆盖大部分可见光和近红外波段的局域等离子共振(localized surface plasmon resonance, LSPR)。SERS技术通过电磁和化学两种机制放大信号，以其高水平的灵敏度和特异性而闻名。已经证明SERS 可用于识别和检测各种细菌菌株。将镀银磁性纳米粒子吸附Pg后加到Si/Ag SERS平台上，记录SERS光谱即可快速检测Pg[33]。这项研究对于快速诊断非常有帮助，有助于开发适当的治疗药物以预防牙周炎。

4.3 质谱检测

近年来质谱技术与荧光成像技术相结合在生物医学检测中得到广泛应用，内源性荧光团被紫外光照射并发出可见光，这种荧光特性可用于检测牙菌斑,可以基于光诱导自发荧光光谱鉴定细菌。在405 nm激发下的Pg荧光光谱在约500 nm处有一个负值谷，约635 nm 处有一个峰，在约705 nm 处有第二个峰，由此可以对细菌分类，检测的敏感性和特异性可达到99%[34]。在Pg中可以检测到原卟啉IX，然而原卟啉的荧光光谱和Pg的荧光光谱一致，猜想Pg的荧光光谱可能归因于原卟啉IX和粪卟啉[35]。