内皮-间质转化在动脉粥样硬化中的研究进展

孙欣怡 周建庆 廉姜芳

冠心病是导致当前全球范围内心血管事件发生的主要原因，发病率仍在逐年上升。动脉粥样硬化的发展主要包括内皮细胞损伤、脂蛋白沉积、炎症和纤维帽形成，是冠心病发生的基础环节，但其分子机制极其复杂，至今尚未完全阐明。20世纪60年代，有学者在对鸡胚进行研究时发现，上皮细胞可以转化为肌样或成纤维细胞样表型细胞，即上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[1]。内皮-间质转化（endothelium-mesenchymal transition，EndMT）作为EMT的一种亚型日益受到临床关注。越来越多的研究证实EndMT可促进动脉粥样硬化发展[2-3]，这为明确冠心病的发病机制和发展过程提供了新证据。本文对EndMT在动脉粥样硬化中的机制、作用的研究进展作一综述。

1 调节EndMT的信号通路

EndMT是指在病理和生理状态下，内皮细胞发生形态和功能紊乱，迁移能力增加，细胞外基质蛋白分泌增加，并逐渐丧失紧密连接的特征，同时血小板黏附分子31（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）、血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cad）、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）等内皮细胞相关蛋白表达水平下调；α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平滑肌细胞22α（smooth muscle cell 22α，SM22α）等间质细胞相关蛋白表达水平上调，逐渐完成内皮细胞向间质细胞转化的过程[3-4]。

EndMT可通过多种生化和生物力学信号通路被激活，如转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路、骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）信号通路、Notch信号通路等，其中占据核心地位的是TGF-β信号通路。

1.1 TGF-β信号通路TGF-β是一种多功能蛋白，在卵巢闭锁、肾脏纤维化、肿瘤生长、非酒精性肝病和炎症反应调节中显示出功能高度多样化[5-8]。在内皮细胞中，TGF-β通过Ⅱ型受体和Ⅰ型受体复合物发出经典信号。随后TGF-β与受体复合物在细胞表面结合，形成活性复合物，并通过Smad1、2、3、5的依次活化在细胞内完成信号传递，最后与Smad 4结合穿梭入细胞核中，当他们与核内辅助激活因子、辅助抑制因子和附加转录因子相互作用时，可引起细胞染色质重排，最终导致EndMT发生[9-10]。TGF-β可被单独用作EndMT的刺激物，或与其他促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）联合使用，以研究各种疾病模型中炎症对EndMT的影响。

1.2 BMP信号通路BMP属于TGF-β信号通路超家族，迄今，超过20个不同功能的BMP已被确定[11]，TGF-β/BMP信号的串扰也已被证实[12]。BMP配体与受体相互作用诱导Smad1、5、8磷酸化，介导下游信号传导[13]。BMP分别与两种不同受体结合，通过Smad依赖和非Smad依赖的途径介导信号转导[14]。研究证实，在促炎诱导的EndMT中，BMPⅡ型受体下调，BMP9诱导的成骨分化和钙化增强，导致c-Jun氨基末端激酶信号通路被抑制，促进血管钙化[15]。有研究表明BMPⅡ型受体在内皮细胞稳态中发挥保护作用，特别是其可通过调节BMP/TGF-β信号来保护细胞，减少内皮细胞对TGF-β反应[16]。除了BMPⅡ型受体，BMP6也具有诱导成骨分化及钙化的能力。活性氧活化是BMP6调节成骨基因、成骨分化和钙化的必需环节[17]。此外，Zhu等[18]发现大脑和肌肉arnt样蛋白-1可通过BMP信号通路抑制活性氧诱导的EndMT，从而抑制动脉粥样硬化斑块形成。

1.3 Notch信号通路Notch信号通路在生物进化中高度保守，表现为通过局部细胞间相互作用调节细胞的分化、增殖和凋亡等[19]。Lin等[20]已证实，Notch信号通路激活可诱导EndMT的进展并促进动脉粥样硬化病变发展。Notch配体Delta4和Notch受体1、2、3、4在房室管和流出道心脏细胞上的表达可在整个EndMT进程中发挥作用。当细胞膜上的Notch受体1与配体结合，蛋白酶发生裂解，释放出Notch1细胞内结构域，迁移至细胞核内，充当转录调控因子，激活或抑制定义细胞特性的基因。Notch1信号通过在心肌上表达的配体Jagged1，抑制BMP介导的EndMT[21]。Chang等[22]证实，Notch蛋白可诱导激活素A促进内皮细胞通过磷酸肌醇3激酶（phosphatidylionsitol 3-kinase，PI3K）/Akt途径分泌一氧化氮，一氧化氮与其受体鸟苷酸环化酶相互作用，调节内皮细胞发生转化。在此过程中，Notch信号通路也可与TGF-β信号通路协同，在Notch信号激活时，释放可溶性Notch1细胞内结构域，上调Smad3相关tRNA，激活Smad依赖型信号传导通路，从两条途径上共同促进EndMT。在体外实验中，Notch信号通路通过增加VE-cad和α-SMA表达诱导EndMT，而γ分泌酶抑制剂可通过抑制Notch信号通路延缓动脉粥样硬化病变的发展[20]。Lin等[20]认为Notch信号通路的激活可诱导EndMT的进展，促进动脉粥样硬化病变发展。

1.4 Wnt/β-连环蛋白信号通路Wnt/β-连环蛋白信号通路可激活细胞核内靶基因的表达，并通过抑制糖原合成酶激酶3β介导的磷酸化作用以及抑制胞质中的β-连环蛋白降解诱发EndMT。β-连环蛋白在细胞内大量累积后会转移进入细胞核内，作为转录因子亚单位诱导EndMT相关基因表达，从基因水平促进EndMT。Lee等[23]表明，Wnt-3a在瘢痕发病机制中诱导EndMT，Wnt-3a可显著降低VE-cad mRNA表达水平，诱导间质细胞标志物在人真皮微血管内皮细胞中的表达上调。

1.5 其他EndMT相关信号通路 除了经典的TGF-β信号通路、BMP信号通路、Notch信号通路、Wnt/β-连环蛋白信号通路外，还有多种信号通路介导了EndMT的作用。Medici等[24]研究证明,促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信号通路、PI3K/Akt激酶信号通路、p38丝裂原激活的蛋白激酶信号通路和抑制性微小RNA（microRNA，miRNA）等，可与TGF-β信号通路相互作用，由TGF-β信号系统整合这些途径，上调Snail转录因子表达水平，诱导EndMT的发展[25]。TGFβ3也可通过Rho激酶和活化素受体样激酶2，诱导EndMT[26]。

2 影响EndMT发生的因素

2.1 成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）TGF-β途径上游的FGF可抑制TGF-β介导的内皮细胞标志物表达。Chen等[27]发现FGF受体1是抑制内皮细胞TGF-β信号转导的关键，FGF受体1丰度降低可促进EndMT和广泛血管病变。连接FGF受体与MAPK的衔接蛋白FRS2可在人脐动脉内皮细胞中诱导内皮细胞凋亡，表现为内皮凋亡相关基因、平滑肌细胞重构相关基因上调。Chen等[28]证实在体外小鼠模型中敲除FRS2后，小鼠主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉和主动脉根部动脉粥样硬化病变数量增加。高脂饮食16周后，FRS2敲除小鼠的动脉粥样硬化病变进一步增加，斑块负荷增加84%。此外，炎性细胞因子，如干扰素-γ、TNF-α和IL-1β，可下调FGF受体1，使内皮细胞对FGF信号的反应性降低，促进EndMT。从目前的研究来看，干预FGF介导的TGF-β信号通路是控制EndMT失衡的有效靶点。

2.2缺氧和缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）HIF是一种转录因子，是氧稳态的主要调节因子，作为细胞的稳定成分，可在低氧状态下被激活和诱导，靶向调节下游基因来介导机体各项生命活动。已有研究发现HIF下游基因与许多神经系统疾病特别是缺血性脑卒中密切相关[29]。体内环境中，HIF-1α在动脉粥样硬化小鼠主动脉弓中表达增加，与斑块负荷最高的区域重叠，同时，具有EndMT标志物的缺氧细胞数量显著增加。体外环境中，免疫荧光实验显示缺氧状态下内皮细胞表型与TGF-β诱导EndMT效果一致。流式细胞检测也证实缺氧可增加内皮细胞间质标志物Sca1蛋白、EndMT标志物Snai1、a-SMA和TGF-β1的mRNA水平。对动脉粥样硬化主动脉中具有EndMT表型的单个细胞进行缺氧检测也证实，缺氧是EndMT的重要因素[30]。斑块破裂导致血栓栓塞是心肌梗死的主要原因，与动脉斑块中的新生血管生成有关。研究表明，HIF-1通过上调血管内皮生长因子促进缺血损伤组织中的血管生成和新生血管形成，最终导致斑块进展、出血和溃疡[31-32]。此外，缺氧条件可诱导心脏微血管内皮细胞发生EndMT和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化。乙酰胆碱可降低缺氧条件下HIF-1α蛋白表达水平，抑制NF-κB活化及诱导自噬来抑制缺氧导致的EndMT，从而延缓动脉粥样硬化进展[33]。

2.3 剪切应力和机械传感器 剪切应力对内皮细胞有调节作用。由于冠状动脉的解剖形态特征，在降主动脉处血流剪切应力较高且方向一致，血流表现为稳定流，稳定流有动脉粥样硬化保护作用，相反，在主动脉弓处血流剪切应力较降主动脉处下降且方向改变，血流表现为扰动流，扰动流主要发生在主动脉弓小弯处，能够促进动脉粥样硬化，主要特点是低震荡切应力。Andueza等[34]通过对暴露于扰动流中的内皮细胞进行单细胞RNA测序，证明内皮细胞有高度异质性和可塑性。低震荡切应力诱导内皮细胞从动脉粥样硬化保护表型转变为促炎细胞、间质细胞、造血干细胞、内皮干细胞和内皮源性免疫细胞样表型。研究证实，非选择性的阳离子通道Piezo1可作为机械传感器针对稳定流和扰动流分别进行对应调节[35]，Piezo1首先触发相同的钙内流形成初始机械信号传导，进而激活内皮反应。在稳定流条件下，Piezo1激活参与抑制动脉粥样硬化的PI3K/eNOS通路。在扰动流条件下，Piezo1激活NF-κB通路以促进炎症反应及动脉粥样硬化[36]。因为NF-κB通路是已知的炎症介导EndMT的通路[37]，因此Piezo1可能在调节扰动流诱导的EndMT中发挥了重要的机械感觉作用。此外，机械传感器激活素受体样激酶5（activin receptor-like kinase 5，Alk5）是调节扰动流诱导的EndMT至关重要的受体。Alk5及其相关蛋白Shc与Smad2介导的EndMT通路激活直接相关[38]。丛蛋白D1也被确定为促进动脉粥样硬化的剪切应力的机械传感器[39]。内皮细胞对扰动流反映的可塑性表明，动脉粥样硬化斑块的进展可能涉及多种细胞类型及机械感受器之间的复杂作用，了解、控制内皮细胞生理病理变化过程，确定在不同血流状态中内皮细胞激活的过渡类型，可能是开发动脉粥样硬化靶向治疗方法的重要考虑因素。

2.4 转录因子和miRNA Snail、Twist是EndMT发生的关键转录因子，均在引起动脉粥样硬化的低稳态切应力部位表达较多。Snail可通过促进内皮细胞增殖和迁移来增强内皮对大分子的渗透性。激活Snail可引起α-SMA、SM22a等间质标志物表达上调，因此可能有助于血管损伤和动脉粥样硬化的形成[40]。但也有研究证实,Snail过度表达不能直接导致EndMT,但抑制Snail表达可防止TGF-β2诱导的EndMT[41]。Twist决定细胞谱系在发育过程中的最终分化状态，对细胞形态变化起重要作用，有Twist1、Twist2两种分型。Twist1可诱导内皮细胞增殖和迁移，促进发育性血管生成，并通过诱导炎症来促进动脉粥样硬化[42]。在肾损伤小鼠模型中，将内皮细胞中Twist1特异性删除，可显著抑制EndMT的出现，改善肾脏纤维化[43]。

此外，微小RNA是转录后调控的关键调控因子，可通过靶向定位转录因子或调控与EndMT诱导相关的信号通路来激活或抑制EndMT。研究证实，miR-122在载脂蛋白E基因敲除小鼠和体外EndMT模型中均呈高表达，在载脂蛋白E基因敲除小鼠中抑制miR-122可以减少斑块形成[44]。同样，抑制miR-122可逆转过氧化氢诱导的EndMT。miR-122可以通过转录因子NPAS3介导的EndMT促进斑块形成，并可能成为治疗动脉粥样硬化的新靶点[44]。LINC00657通过miRNA-30c-5p积极调节Wnt7b/β-连环蛋白激活以促进EndMT[45]。长链非编码RNA ZFAS1通过抑制miR-150-5p触发EndMT，从而增加EndMT调控因子Notch3的表达[46]。Yoshimatsu等[47]证实TNF-α可加强TGF-β信号从而增强TGF-β诱导的EndMT。转录因子活化T细胞核因子1、GATA结合蛋白4、转录因子SOX9和多功能蛋白聚糖也参与了EndMT。

3 EndMT参与动脉粥样硬化斑块形成并影响斑块稳定性

由于动脉粥样硬化的病理生理学机制涉及多种细胞类型，包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞和免疫细胞等。因此人们对这些细胞的分化、功能改变进行了研究。目前，EndMT被认为是导致内皮细胞分化为促动脉粥样硬化细胞的一个关键过程[48]。

3.1 EndMT是动脉粥样硬化斑块中间质细胞的来源之一 以间质细胞作为来源的平滑肌样细胞数量增加是动脉粥样硬化病理生理过程中的特征。传统认识中，心肌固有的平滑肌细胞被认为是动脉粥样硬化平滑肌细胞增殖的唯一来源，但Evrard等[3]利用Scl启动子成功开发出内皮特异性功能性环化重组酶，通过内皮谱系跟踪系统确定，小鼠内膜斑块中所有成纤维细胞样细胞中19%来源于内皮源性细胞，外膜中7%～16%的成纤维细胞样细胞来自内皮源性细胞。新近，Depuydt等[49]对人类晚期动脉粥样硬化斑块进行单细胞转录组分析，识别出斑块内存在同时具有平滑肌和内皮细胞特征的EndMT细胞簇。这证实EndMT可能在动脉粥样硬化的进展中发挥积极作用，是动脉粥样硬化斑块中间质细胞的来源之一。

3.2 EndMT调节巨噬细胞表型及功能 巨噬细胞随组织微环境变化具有高度可塑性，这使巨噬细胞能够获得不同表型，并在复杂的生理过程中发挥作用。巨噬细胞可在体外动脉粥样硬化血管壁上积累，影响内皮细胞向EndMT表型转变，而EndMT细胞可调节巨噬细胞表型和脂质摄取。体外实验发现，EndMT可同时影响动脉粥样硬化斑块表面结构和斑块内部，改变巨噬细胞和内皮细胞的表型。在功能上，EndMT减弱了巨噬细胞的增殖，抗原呈递细胞标志物的表达，以及氧化低密度脂蛋白反应中TNF-α的产生，并且增加氧化低密度脂蛋白的摄取[50]。EndMT可促进巨噬细胞向吞噬细胞表型转变并减弱巨噬细胞增殖。报道认为，吞噬细胞增多可能有利于减少坏死核心和动脉粥样硬化病灶的大小[51-52]。巨噬细胞增殖减少，活化低密度脂蛋白引起的TNF-α生成减少，EndMT细胞分泌因子引起的抗原呈递细胞标志物减少，都可能共同促进炎症减少，从而使斑块表型更加稳定[53]，这也意味着EndMT对巨噬细胞的影响具有潜在的抗炎作用。

3.3 EndMT与斑块稳定性Evrard等[3]分别检测稳定纤维粥样斑块和不稳定粥样斑块EndMT细胞比例，证实在不稳定斑块中EndMT细胞比例较高，此外斑块纤维帽的形成与EndMT细胞比例之间也呈反比关系。由此可见，EndMT与动脉粥样硬化不稳定斑块和斑块破裂的出现有直接联系。但另一方面，EndMT也可能有助于斑块的稳定性。EndMT诱导内皮细胞分化为肌纤维母细胞样细胞，而肌纤维母细胞样细胞聚集在与稳定的动脉粥样硬化斑块相关的厚纤维帽中[54]。此外，由于EndMT对巨噬细胞具有潜在抗炎作用，因此，可以推测EndMT对动脉粥样硬化斑块稳定可能起到动态调节作用。

3.4 药物抑制EndMT延缓动脉粥样硬化EndMT是治疗心血管疾病的有效靶点。已有研究证实，部分药物可能通过抑制EndMT，延缓动脉粥样硬化发展。淫羊藿苷通过H19/miR-148b-3p/ELF5轴抑制氧化低密度脂蛋白诱导的EndMT，抑制动脉粥样硬化[55]。组蛋白去乙酰化酶3在动脉粥样硬化病变中表达增加，RGFP966是组蛋白去乙酰化酶3的选择性抑制剂，可抑制主动脉根部EndMT，减少动脉粥样硬化病变[56-57]。此外，临床降脂药物辛伐他汀被证明可通过上调人脐静脉内皮细胞中Krtippel样因子4/miR-483轴抑制EndMT。辛伐他汀也可通过抑制氧化应激和TGF-β/Smad信号通路，减弱EndMT，起到治疗动脉粥样硬化的积极作用[58]。以上研究均证实抑制EndMT在动脉粥样硬化治疗中的潜力。然而遗憾的是，目前仍缺乏有效逆转EndMT的药物以用于动脉粥样硬化治疗。

4 结语与展望

随着对EndMT研究的深入，学者们逐渐意识到对EndMT的程度评估和功能定义仍缺乏共识，目前主要通过监测各种内皮和间质标志物表达水平来评估EndMT的进展。但由于已知的内皮、间质标志物表达具有时间依赖性，对主要通过标志物表达水平来评估EndMT的评价体系不利。细胞机械表型技术已证明其在异质性肿瘤中识别不同表型细胞的能力，评估转化细胞的机械表型能够仅根据细胞变形能力确定细胞更倾向于间质细胞还是上皮细胞。由此推测，这种技术方法可通过动态监测细胞机械表型，克服传统使用细胞表面标志物评估EndMT的局限，为建立更加精确的EndMT评估体系提供新思路。EndMT是一种复杂、多层面的现象，众多激活因子和信号通路参与其中，研究也证实，EndMT还有一个反向对应的转变称为“间质-内皮转化”,有助于心脏损伤后血管新生，这为未来心血管疾病治疗提供了积极思路。此外，EndMT在发育和疾病以外的稳态条件中的作用尚缺乏深入研究，探索内皮可塑性和如何平衡EndMT的保护和危害作用将变得更有价值。