仔猪腹泻病例的RT-PCR诊断

张婧旭 ， 梁海英 ， 曾智勇 ， 汤德元 ， 王 彬 ， 万 娟 ， 徐松平 ， 黄二素 ， 徐 玉 ， 祝 羊

(贵州大学动物科学学院 ， 贵州 贵阳 550025)

2020年10月初，贵州省安顺市某猪场7日龄仔猪发生严重腹泻，病程初期猪只发生腹泻、食欲废绝、精神不济、不愿走动，后期由于抗生素治疗无效，猪只持续性腹泻导致大量脱水死亡。为明确引起腹泻的具体病原，对送检腹泻病死仔猪的肠内容物分别进行了猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和猪丁型冠状病毒(Porcine delta coronavirus,PDCoV)的反转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)诊断，现将诊断过程和结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 待检样品 贵州省安顺市某猪场送检的7日龄腹泻病死仔猪的肠内容物。

1.2 主要试剂 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2.0、pMD19T vector、DL2 000 Marker,均购自宝生物工程(大连)有限公司;胶回收试剂盒,购自OMEGA生物有限公司。

1.3 4种病毒的RT-PCR检测 将腹泻病死仔猪的肠内容物于12 000 r/min离心5 min,取上清。按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒说明书的操作步骤提取核酸。参照参考文献[1-2]设计并合成PEDV、PoRV、TGEV和PDCoV的RT-PCR引物，应用Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2.0试剂盒，进行RT-PCR检测。反应体系(25.0 μL):2×1 Step Buffer 12.5 μL,Prime Script 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL,模板3.0 μL,上、下游引物各1.0 μL，RNase Free ddH2O补充至25.0 μL。反应程序：50 ℃反转录40 min；94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s,共38个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL RT-PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 PoRVVP7基因扩增及序列分析

1.4.1 PoRVVP7基因的RT-PCR扩增 参考GenBank数据库中PoRVVP7基因序列，在两端保守区域设计1对通用引物，上游引物：5′-GGCTTTAAAAGMGAGAATTTCC-3′；下游引物：5′-GGTCACATCAWACARYTCTAMY-3′。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。预计扩增基因片段大小为1 062 bp。以提取的RNA为模板进行反转录,首先置于95 ℃温浴5 min，快速置于冰上5 min解开双链，加入引物，用Prime Script 1 Step Enzyme Mix进行反转录,反应体系同1.3。反应程序：50 ℃反转录40 min；94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,共40个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL RT-PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2 PoRVVP7基因的序列分析 将上述RT-PCR产物回收纯化，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序获得的序列进行BLAST比对，并应用MegAlign软件，将GenBank上公布的VP7基因的G3、G4、G5、G6、G8、G9、G10血清型序列与该序列进行亲缘性分析，构建VP7基因序列的遗传进化树。

2 结果

2.1 4种病毒的RT-PCR检测 电泳结果显示，TGEV(531 bp)、PEDV(663 bp)、PDCoV(357 bp)呈阴性，未扩增出条带，PoRV(341 bp)呈阳性，扩增出与预期大小相符的目的条带，见图1。

图1 样品的RT-PCR检测Fig.1 RT-PCR test of samplesM:DL2 000 DNA Marker; 1:TGEV; 2:PEDV; 3:PoRV; 4:PDCoV

2.2 PoRVVP7基因的扩增及序列分析 PoRVVP7基因的RT-PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，可看到约1 062 bp的特异性条带，与预期的目的条带大小相符(图2)。测序所得序列[GZAS(2020)]与G5血清型处于同一分支，同源性最近，与其他血清型处于不同分支，同缘性较远(图3)。

图2 PoRV VP7基因的RT-PCR扩增Fig.2 RT-PCR amplification of PoRV VP7 geneM：DL2 000 DNA Marker； 1：PoRV VP7基因M:DL2 000 DNA Marker; 1:PoRV VP7 gene

图3 PoRV VP7基因的遗传进化树Fig.3 Evolutionary tree of PoRV VP7 gene▲:本试验所得分离株▲:Strain obtained in this study

3 讨论

本试验通过对腹泻病死仔猪肠道内容物进行TGEV、PEDV、PDCoV、PoRV的RT-PCR检测，排除了TGEV、PEDV、PDCoV三个常见致腹泻病毒的感染。腹泻病死仔猪肠内容物含有PoRV，说明该猪场存在PoRV感染的情况。随后设计引物对VP7基因进行序列的扩增及测序，构建GZAS(2020)的遗传进化树，确定GZAS(2020)VP7全基因的具体血清型。序列分析结果显示，GZAS(2020)VP7全基因属于PoRV A群G5血清型。对于该病尚无有效的治疗药物，故本病以预防为主，要做好猪只的日常饲养管理工作，分不同饲养批次消毒处理，全进全出，注意防寒保暖，增强动物的抵抗力。新生仔猪尽早吮食初乳，以获得母源抗体的保护，当仔猪发生腹泻后应立即停止哺乳。在实际治疗过程中，由于该病的临床症状主要为腹泻，故在病程严重时会因脱水发生酸碱平衡紊乱而造成猪只死亡，饮用葡萄糖生理盐水和碳酸氢钠溶液有防止脱水和酸中毒的作用，对延缓病情起到较好的效果，同时高能量的日粮和限期饲喂可降低猪只的发病率和死亡率[3-4]。

1974年，英国Woode等首次从猪体分离出PoRV[5],随后感染PoRV导致仔猪腹泻死亡的病例在北爱尔兰、澳大利亚、法国、美国等国家陆续报道,PoRV的广泛传播逐渐引起了世界各国的重视[6]。PoRV主要感染幼龄仔猪，患病猪和带毒猪是主要传染源，经消化道感染，传播迅速，流行面广。饲喂非全价饲料，应激，在寒冷、潮湿、卫生不良的饲养环境下，继发或并发其他疾病等都可加重病情[7]。仔猪患腹泻病的情况在猪场非常普遍且发病情况日益严重，猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)、猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TEG)、猪轮状病毒病(Porcine rotavirus disease,RV)、猪丁型冠状病毒病(Porcine delta coronavirus disease,PDCo)是严重困扰养猪场的病毒性传染病，发病时的临床症状极为相似，难以鉴别，一旦猪群发病会导致大范围的迅速传播，同时病毒难以净化，为了加强这4种腹泻疾病的防控，避免造成巨大的经济损失，通常养殖场发生腹泻类疾病时会要求同时检测这几种病毒，以便及时采取有效的防控治疗措施[8-9]。动物源的轮状病毒是人新型轮状病毒的潜在来源，具有非常重要的公共卫生学意义[10]。