榆银虾康散的质量标准研究

朱洪洋 ， 张 正 ， 王春元 ， 王印庚 ， 袁春营 ， 于永翔 ， 张 杨 ， 赵伟志

(1.天津科技大学海洋与环境学院 ， 天津 滨海新区 300450 ； 2. 农业农村部海水养殖病害防治重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究 ， 山东 青岛 266000 ； 3. 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 ， 山东 青岛 266000)

2020年我国水产养殖因病害造成的经济损失约589亿元，约占水产养殖总产值的5.8%[1]。急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreas necrosis disease,AHPND)是影响国内外对虾健康的最严重的疾病之一，其特点是传播速度快、流行范围广、死亡率高[2]。AHPND已经给全球的对虾养殖业造成了巨大的经济损失[3-7]，目前主要采用抗生素等化学类药物进行治疗，但化学药物长期、大量的应用，会带来环境污染、药物残留等诸多问题，并加速耐药菌株的产生。中草药具有纯天然、无污染等优点，将是未来渔药发展的一个重要方向。榆银虾康散是针对海水养殖致病性弧菌，通过科学的药物筛选及合理组方研制出的中药散剂，具有环境污染小，药物残留低，不易产生耐药性等特点，通过药效学研究证实其对副溶血弧菌具有良好的抑制作用[8-10]。中药散剂的质量控制一般从性状、鉴别、检查、含量测定等方面进行[11-14]。因此，建立榆银虾康散简便、可行的检测方法对制剂生产的质量控制具有重要意义。为了有效控制该产品的质量，本试验采用薄层色谱法(Thin layer chromatography,TLC)定性鉴别复方中的地榆、黄柏、黄芩和山银花，采用光散射法对散剂粒度分布进行检查，使用高效液相色谱法(High performance liquid chromatogrphy,HPLC)测定复方中黄芩苷的含量，以期建立榆银虾康散的质量标准。

1 材料与方法

1.1 试验药品与试剂 榆银虾康散，规格：100 g/袋，批号为20210717、20210718、20210719。绿原酸对照品，批号为110753-202018；黄芩苷对照品，批号为110715-202122；没食子酸对照品，批号为110831-201906；盐酸小檗碱对照品，批号为110713-202015；地榆对照药材：1 g/支，批号为121286-201703；山银花对照药材：1 g/支，批号为121595-201202；黄芩对照药材：0.5 g/支，批号为120955-201810；黄柏对照药材：0.5 g/支，批号为121510-201807；以上均购自中国食品药品检定研究院。

无水乙醇：HPLC级，科密欧。甲醇：HPLC级，Supelco。磷酸：HPLC级，Fisher Chemical。甲苯，HPLC级，购自成都市科龙化工试剂厂。丙酮、盐酸、乙酸乙酯、甲酸、乙醚、乙醇、甲醇、三氯化铁，均为AR级，购自国药集团化学试剂有限公司；二氧化硅：仪器标准样，累计含量为50%时对应的粒径D(50)的标准值为50 μm，美国Microtrac公司产品。

1.2 主要仪器 KQ5200型超声波清洗器；XSE205DU精密天平(梅特勒-托利多有限公司)；LC-20A液相色谱仪(日本岛津公司)；Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美国安捷伦科技有限公司)；SPD-20A检测器，SPD-M20A检测器(日本岛津公司)；LabSolutions色谱工作站；platisil-ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(上海迪马科技有限公司)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)；薄层色谱摄影仪(天津市思利达科技有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 薄层色谱鉴别

1.3.1.1 地榆的鉴别 取榆银虾康散(批号为20210717、20210718、20210719)粉末3 g，按照2020版《中华人民共和国兽药典》二部地榆项下方法处理，最后加2 mL甲醇溶解残渣作为供试品溶液。取地榆对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。取没食子酸对照品1 mg，加甲醇制成0.5 mg/mL的对照品溶液。按榆银虾康散成分比例，制成不含地榆的榆银虾康散，按照供试品溶液方法，制备出地榆阴性对照溶液。参照2020版《中华人民共和国兽药典》二部地榆项下方法进行展开并检视。

1.3.1.2 黄柏的鉴别 取榆银虾康散(批号为20210717、20210718、20210719)粉末0.4 g，加10 mL甲醇后加热回流30 min，过滤残渣，取滤液作为供试品溶液。取黄柏对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。精密称定盐酸小檗碱对照品1 mg，加甲醇制成0.5 mg/mL的对照品溶液。按榆银虾康散成分比例，取除黄柏外的其余药材，制成不含黄柏的榆银虾康散，按照供试品溶液方法，制备出黄柏阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下观察。

1.3.1.3 黄芩和山银花的鉴别 取榆银虾康散(批号为20210717、20210718、20210719)粉末2 g，加15 mL甲醇后静置12 h，过滤后将滤液挥干，再加5 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。分别取黄芩药材粉末0.6 g和山银花药材粉末0.2 g，按照供试品溶液方法制成对照药材溶液。取黄芩苷对照品和绿原酸对照品各1 mg，分别加甲醇制成1 mg/mL的对照品溶液。按榆银虾康散成分比例，分别取除黄芩、黄柏、山银花、山银花和黄柏外的其余药材，按工艺要求制成不含这些药材的阴性对照样品，按照供试品溶液制备方法操作，制得缺少黄芩、黄柏、山银花、山银花和黄柏的阴性对照溶液。参照2020版《中华人民共和国兽药典》二部银黄提取物口服液项下方法进行展开并检视。

1.3.2 粒度分布检查 取适量榆银虾康散(批号为20210717、20210718、20210719)置于激光散射粒度分析仪的样品槽中，使样品平铺均匀，检测粒度分布。设备参数：空气压力：20psi；折光率：2.0；Transpatency方式：Transparent；Distribution：Number；Shape：Irregular；进样时间：5 s。每个批次样品分别测定3次，取平均值。

1.3.3 黄芩苷的含量测定

1.3.3.1 色谱条件 用Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温为30 ℃，流速为1 mL/min，检测波长为280 nm；流动相比例为甲醇∶水∶磷酸(47∶53∶0.2)。

1.3.3.2 供试品溶液的制备 研究以下2种提取方法对提取效率的影响。(1)加热回流提取：分别取本品粉末3份，每份精密称定约0.5 g，加70%乙醇40 mL后加热回流3 h，冷却后过滤，滤液置100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70%乙醇定容，摇匀，精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀即得。(2)超声提取：分别取本品粉末8份，每份精密称定约0.5 g，置100 mL量瓶中，加 70%乙醇70 mL，分别超声处理20、30、40 min和60 min，冷却后用70%乙醇定容，摇匀，滤过，精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀即得。

精密吸取上述供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。

1.3.3.3 对照品溶液 精密称定黄芩苷对照品10.42 mg，加甲醇制成每1 mL含59.65 μg黄芩苷的溶液，即得。

1.3.3.4 阴性对照品溶液 按榆银虾康散成分比例，制备不含黄芩的榆银虾康散，按1.3.3.2中确定的制备方法配制缺少黄芩的阴性对照品溶液。

1.3.3.5 系统适应性试验 取上述3种溶液各10 μL测定，考察供试品溶液的理论塔板数、分离度、专属性。

1.3.3.6 线性关系考察 精确称取黄芩苷对照品10.42 mg(按纯度95.4%)，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，摇匀作为标准品储备液。分别取适量储备液，用甲醇稀释成9.94、29.82、59.65、79.53 μg/mL和99.41 μg/mL一系列浓度的对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液10 μL，测定。以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。

1.3.3.7 精密度试验 吸取浓度为59.65 μg/mL的对照品溶液10 μL，重复进样6次，进行仪器精密度试验。在同一实验室，用不同仪器、不同时间、不同操作者考察，分别用岛津LC-20A SPD-M20A高效液相色谱仪和岛津LC-20A SPD-20A高效液相色谱仪进样分析，计算黄芩苷含量，计算相对标准偏差(RSD)，进行中间精密度试验。

1.3.3.8 日间稳定性试验 精密称取样品0.5 g，按1.3.3.2确定的方法制备供试品溶液，在制备后0、2、4、8 h和12 h各进样1次，测定峰面积，计算精密度。

1.3.3.9 重复性试验 精密称取样品6份，每份精密称取0.5 g，按1.3.3.2确定的方法制备供试品溶液，各进样10 μL，检测并记录峰面积，计算RSD值。

1.3.3.10 加样回收率试验 取本品(黄芩苷含量44.97 mg/g)约0.25 g，精密称取6份，分别精密加入黄芩苷对照品12 mg，制备供试品溶液，进样，计算回收率。

1.3.3.11 耐用性试验 取同一批号样品，按1.3.3.2确定的方法制备供试品溶液，分别考察流动相比例变化±5%、柱温变化±5 ℃、流速±0.1 mL/min对样品色谱行为的影响，记录色谱图。观察黄芩苷和临近峰的基线分离情况。

1.3.3.12 榆银虾康散样品测定 取榆银虾康散样品3批，各批次取平行样品2份，按1.3.3.2确定的方法制备供试品溶液，每份样品进样量10 μL，记录峰面积并计算黄芩苷含量。

2 结果

2.1 地榆的薄层色谱鉴别 供试品溶液与对照品溶液和对照药材溶液在色谱中同一位置显示出一样颜色的斑点，而缺少地榆的榆银虾康散阴性对照溶液没有相应的斑点(图1)。

图1 地榆的薄层色谱图Fig.1 Thin-layer chromatography of Sanguisorbae radix1～3：供试品溶液(批号：20210717，20210718，20210719)； 4：没食子酸对照品溶液； 5：地榆对照药材溶液； 6：缺少地榆的阴性对照溶液1-3:Test solution (batch number:20210717,20210718,20210719); 4:Control solution of gallic acid; 5:Control herbs solution of Sanguisorbae radix; 6:Negative control solution without Sanguisorbae radix

2.2 黄柏的薄层色谱鉴别 供试品溶液与对照品溶液和对照药材溶液在色谱中同一位置显示出一样的荧光斑点，而缺少黄柏的榆银虾康散阴性对照溶液没有相应的斑点(图2)。

图2 黄柏的薄层色谱图Fig.2 Thin-layer chromatography of P.cidnensis cortex1～3：供试品溶液(批号：20210717、 20210718、 20210719)； 4：盐酸小檗碱对照品溶液； 5：黄柏对照药材溶液； 6：缺少黄柏的阴性对照溶液1-3:Test solution (batch number:20210717,20210718,20210719); 4:Control solution of berberine hydrochloride; 5:Control herbs solution of P.cidnensis cortex; 6:Negative control solution without P.cidnensis cortex

2.3 黄芩和山银花的薄层色谱鉴别 供试品溶液与黄芩苷对照品溶液和黄芩对照药材溶液在色谱中同一位置显示出一样的暗色斑点，且缺少黄芩的阴性对照溶液没有相应的斑点；供试品溶液与绿原酸对照品溶液和山银花对照药材溶液在色谱中同一位置显示出一样的荧光斑点，且缺少山银花阴性对照溶液和缺少黄柏阴性对照溶液都有荧光强度较暗的斑点，缺少山银花和黄柏阴性对照溶液无相应的斑点(图3)。

图3 黄芩和山银花的薄层色谱图Fig.3 Thin-layer chromatography of Scutellariae radix and L. flos1～3：供试品溶液(批号：20210717、 20210718、 20210719)； 4：黄芩苷对照品溶液； 5：黄芩对照药材溶液； 6：缺少黄芩阴性对照溶液； 7：绿原酸对照品溶液； 8：山银花对照药材溶液； 9：缺少山银花阴性对照溶液； 10：缺少黄柏阴性对照溶液； 11：缺少黄柏和山银花阴性对照溶液1-3:Test solution (batch number:20210717,20210718,20210719); 4:Control solution of baicalin; 5:Control herbs solution of Scutellariae radix; 6:Negative control solution without Scutellariae radix; 7:Control solution of chlorogenic acid; 8:Control herbs solution of L. flos; 9:Negative control solution without L. flos; 10:Negative control solution without P. cidnensis cortex; 11:Negative control solution without P. cidnensis cortex and L. flos

2.4 粒度分布检查 3批样品粒度分布检查结果显示，<75 μm的颗粒比例分别为99.4%、99.0%和99.0%，RSD为0.22%。结果表明，3批散剂的颗粒均匀度相对较好，且均符合粒度的要求。

2.5 黄芩苷的含量测定

2.5.1 样品溶液制备方法考察 由表1可知，超声提取的方法不稳定，供试品溶液的制备方法确定为：精密称定本品粉末约0.5 g，加40 mL 70%的乙醇溶液，加热回流3 h，放置冷却后过滤至100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70%乙醇定容。精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

表1 供试品溶液不同提取方法考察Table 1 Investigation on different extraction methods of test solution

2.5.2 系统适应性试验 结果显示，理论塔板数按黄芩苷计为4 239，符合《中华人民共和国兽药典》规定不低于2 500。专属性考察结果如图4所示，在1.3.3.1色谱条件下样品中黄芩苷与相邻杂质峰分离良好，阴性对照在黄芩苷出峰时间无色谱峰，检测无干扰。

图4 黄芩苷的系统适应性试验HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of system adaptability test of baicalinA：黄芩苷对照品溶液； B：缺少黄芩的阴性对照溶液； C：供试品溶液A:Control solution of baicalin; B:Negative control solution without Scutellariae radix; C:Test solution

2.5.3 线性关系考察 以黄芩苷进样含量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。试验结果显示，黄芩苷在9.94～99.41 μg/mL范围内，进样浓度与峰面积积分值线性关系良好：Y=36 881X-29 331(R2=0.999 6)(图5)。

图5 黄芩苷标准曲线Fig.5 Standard curve of baicalin

2.5.4 精密度试验 经计算RSD为0.19%(n=6)，符合《中华人民共和国兽药典》规定RSD不大于2.0%，表明该方法具有良好的精密度。在同一个实验室，用不同仪器、不同时间、不同操作者，按建立的色谱条件，分别用LC-20A SPD-20A高效液相色谱仪和岛津LC-20A SPD-M20A高效液相色谱仪进样分析，经计算RSD为0.62%，表明中间精密度良好。

2.5.5 日间稳定性试验 经计算RSD为0.14%，表明12 h内样品具有良好的稳定性。

2.5.6 重复性试验 测定的黄芩苷平均含量为41.89 mg/g，RSD为1.14%，表明该检测方法重复性良好。

2.5.7 加样回收率试验 结果如表2所示，平均加样回收率为100.95%，RSD为0.45%，表明该方法加样回收率良好。

表2 黄芩苷加样回收率试验Table 2 Recovery test of baicalin

2.5.8 耐用性试验 结果表明，柱温分别为20 ℃、25 ℃、30 ℃时RSD为0.50%；流动相比例分别为甲醇∶水∶磷酸(47∶53∶0.2)、甲醇∶水∶磷酸(45∶55∶0.2)、甲醇∶水∶磷酸(50∶50∶0.2)时，RSD为2.17%；流速分别为0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min时，RSD为9.16%，峰面积偏差或含量变化较小，能保证测定结果的准确性。

2.5.9 榆银虾康散样品测定 经测定，3批榆银虾康散的黄芩苷含量分别为40.77、40.08 mg/g和38.62 mg/g,表明不同批号的榆银虾康散中黄芩苷的含量稳定性较好。

3 讨论

中药处方的定性鉴别研究主要目的是保证在生产流通过程中不会出现少药、伪药、违规添加等现象。在中药处方的鉴别研究中原则上应对处方中所有药味进行鉴别研究，《中华人民共和国兽药典》2020年版记载的154种散剂中主要鉴别方法为显微鉴别、薄层色谱鉴别和理化鉴别。考虑到榆银虾康散是由地榆、黄柏、黄芩和山银花四味中药经粉碎后通过200目筛而制成的散剂，部分植物细胞已破碎，不能完整体现单味药材的显微特征，重现性和专属性不强。因此，本制剂质量标准不采用显微鉴别的方法。而薄层色谱法具有直观性强、分离度好、简单易操作等优点，所以在榆银虾康散鉴别研究过程中只采用薄层色谱法对处方中四味药进行定性鉴别。在黄柏的鉴别研究过程中，首先采用《中华人民共和国兽药典》2020版二部黄柏项下的薄层鉴别方法，以盐酸黄柏碱作为对照品[15]，发现该方法操作复杂，且供试品色谱中盐酸黄柏碱斑点不清晰；其后，尝试《中华人民共和国药典》2020年版一部复方黄柏液涂剂项下的鉴别方法，改用盐酸小檗碱作为对照品[16]，该方法供试品斑点清晰，并获得了良好的重现性。需要特别指出的是，在山银花的鉴别研究中，采用绿原酸对山银花进行鉴别[15,17]，结果发现，因黄柏中也含有少量绿原酸，导致缺少山银花的阴性对照溶液(含有黄柏)也出现较暗的荧光斑点，所以对其山银花中绿原酸鉴别稍有干扰。但因黄柏出现的荧光斑点亮度大大低于因山银花出现的荧光斑点，所以，该方法仍可用作榆银虾康散中山银花的鉴别。

根据已有研究报道，散剂降低粒度可以提高有效成分溶出率、增加体内吸收、提高生物利用度，最终达到增强疗效的目的[18-19]。从对虾生物学特征来看，其消化道短，那么药物吸收时间也较短；为此，榆银虾康散的粒度越细其疗效越好。本课题组制成不同粒度的榆银虾康散药液，对AHPND致病原副溶血弧菌的体外抑菌效果进行观察，结果显示其抑菌效果为300目>200目>80目(相关结果将另行发表)。《中华人民共和国兽药典》2020年版关于散剂粒度的要求为通过5号筛(80目)的粉末不少于95%，微粉剂的粒度要求为小于48 μm(300目)的粉末不少于95%。考虑到微粉剂生产成本较高，所以榆银虾康散的粒度选定为200目，该粒度范围仍属于散剂。

除对榆银虾康散的药味进行定性鉴别外，对处方中主效成分进行含量测定也是控制榆银虾康散质量的有效手段。黄芩是榆银虾康散中主要药味，其所含的成分主要为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类物质，其中黄芩苷的含量高、性质稳定，在中药材及制剂标准中常作为含量测定的指标成分。因此，本试验采用高效液相色谱法对处方中黄芩主要成分黄芩苷进行含量测定，可对榆银虾康散成分含量进行定量化监测。本试验中对影响黄芩苷含量的供试品提取方法进行了比较分析，确定黄芩苷供试品溶液采用加热回流法制备，在最终的色谱条件下，该方法分离度好，精密度高，重现性好，阴性无干扰，可用作处方中黄芩苷的含量测定方法。

综上，本试验通过薄层色谱法对榆银虾康散中主要成分(地榆、黄柏、黄芩、山银花)进行定性鉴别、采用光散射法对粒度分布进行检查以及高效液相色谱法对黄芩苷进行含量测定，建立了一套该散剂主要成分的定性、定量分析方法，操作简便、重现性好、精密度高，能够作为榆银虾康散的质量控制标准。本试验为该种散剂的深入研究提供了质量标准，也为申报新渔药提供了试验数据和参考资料。