DPPs类有机磷农药宽谱酶联免疫吸附分析方法的建立

2022-02-08吕丽兰陆覃昱邹承武甘志勇李冬桂吴静娜王艺霖李鑫生何丽珊

西南农业学报 2022年11期

吕丽兰，张娅，陆覃昱，邹承武，甘志勇，李冬桂，吴静娜，王艺霖，李鑫生，何丽珊

(1.广西亚热带作物研究所/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(南宁)/农业农村部亚热带果品蔬菜质量监督检验测试中心，南宁 530001；2.广西大学农学院/广西农业环境与农产品安全重点实验室，南宁 530004)

【研究意义】具有广谱、高效特性的有机磷农药在农业生产过程中已广泛应用于抑制微生物、昆虫和杂草生长[1]。然而，有机磷农药作为传统的中高毒农药，不仅具有一般毒性，可能对人体的遗传、神经及生殖发育也存在毒性[2-3]，还会对土壤和水体环境产生不良影响[4-5]。已有研究表明，果蔬样品中均可检出有机磷残留，且部分样品存在残留超标情况[6-7]。间接竞争酶联免疫吸附分析法(ic-ELISA)是一种灵敏度高、方便快捷、成本低廉及可批量分析样本的检测方法，已应用于食品中农药残留、病原微生物、生物毒素、转基因食品、重金属残留、过敏性残留物及违规添加成分等的检测，但目前仍未广泛应用于有机磷农药检测。因此，通过DPPs的共性结构设计合成通用半抗原以制备广谱性更强的抗DPPs单克隆抗体，筛选符合检测要求的抗体识别对象并建立其ic-ELISA，对开展大规模农产品有机磷农药残留监测及保证农产品质量安全和消费者健康具有重要意义。【前人研究进展】曾剑锋[8]研究认为，开发基于广谱性单克隆抗体的ic-ELISA，对有机磷农药多残留检测技术的推进具有市场应用价值。目前，有机磷类农药残留的检测方法主要包括色谱法[9-10]、酶抑制法[11-13]和酶联免疫法[14-15]。色谱法虽然技术相对成熟，但因开展检测工作所需设备昂贵，操作过程繁琐且耗时长，无法适应大规模快速筛查及满足基层单位应用的需求。酶抑制法虽然在高通量筛查过程中具有明显的技术优势，但酶试剂稳定性较差，其分析结果易产生较大不确定性且重复性也较差[16]。传统单克隆抗体窄谱识别造成方法漏检的可能性极大增加，已无法适应目前农产品质量安全监管需要。多残留检测主要依赖气相质谱法(GC)[17]和液相质谱法(LC)[18]，这2种方法对设备性能及检测人员的技能要求较高，不方便基层开展农药残留监测。因此，开发宽谱农残检测抗体，适应基层农药普筛需求，是ELISA农残检测的重要研究方向。复合免疫法、双特异性抗体法和通用半抗原法等被认为是主流的多残留免疫分析方法[19]，其中通用半抗原法是最常用的方法[20]。刘运清等[21]针对甲基对硫磷、杀螟硫磷和倍硫磷开发了ic-ELISA，最低检出限分别达0.94、1.07和2.79 mg/L。李永祥等[22]制备4种宽谱特异性抗体，可实现对异氯磷、杀螟腈和倍硫磷等8种高毒农药的多残留分析，检出限达2.60 μg/kg，符合相关限量标准要求。但值得注意的是，多数宽谱抗体所覆盖的农药中，日常监测中出现的农药覆盖度不高。有机磷类农药以DPPs为主，选择其药效官能团硫代磷酸二乙酯为抗原决定簇可制备检测灵敏度更高及广谱性更强的单克隆抗体[23]。【本研究切入点】至今，针对有机磷农药分析抗体选择有限及应用范围较少现状的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过DPPs的共性结构设计合成通用半抗原以制备广谱性更强的抗DPPs单克隆抗体，同时筛选符合检测要求的抗体识别对象并建立其ic-ELISA，为开发农产品安全生产中有机磷农药残留快检技术提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020年2—8月在广西大学广西农业环境与农产品质量安全重点实验室进行。试验用小鼠(6～7周龄，Balb/c雌性)购自广州动物实验中心，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由广西农业环境与农产品质量安全重点实验室保存提供；添加回收试验使用的柑橘和鲜橙购自广西南宁市海吉星农产品批发市场。有机磷农药标准品(对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷、甲拌磷、甲基对硫磷和倍硫磷)购自农业农村部环境保护科研监测所；免疫及细胞培养用相关生化试剂购自美国Sigma公司；相关酶标二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

主要仪器设备：分光光度计(UV-1800，日本岛津)、倒置显微镜(Moshot MSX2，广州明美)、酶标仪(Infinite M200，瑞士TECAN)、CO2培养箱(Herocell 180，美国赛默飞)、气相色谱仪(6890N-FPD，美国安捷伦)。

表1 小鼠免疫方案

1.2 半抗原设计、合成及单克隆抗体制备

参照Xu等[24]的方法合成和鉴定半抗原和完全抗原。合成的半抗原4-(二乙氧基硫代磷酰氧基)-肉桂酸结构式如图1-A所示。采用活泼酯法[25]制备免疫抗原(DPPs-BSA，抗原与牛血清蛋白BSA偶联)和包被抗原(DPPs-OVA，抗原与卵清蛋白肽OVA偶联)。完全抗原的合成结构如图1-B所示，对目标产物进行紫外吸收光谱扫描鉴定。

1.3 小鼠免疫及其血清评价

将免疫原稀释至1.0 mg/mL(0.01 mol/L PBS)，免疫时间、剂量及注射部位见表1。将完全弗氏佐剂与免疫原等体积混合后充分乳化，选取5只小鼠进行初免；三免后第7天，眼周采血，离心分离血清，ic-ELISA检测血清效价，选取效价最高的小鼠为融合小鼠；融合前4 d进行加强免疫。

杂交瘤细胞制备及筛选：采用PEG-2000(50%)对小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞(细胞数目比约10∶1) 进行融合。培养9～11 d后，采用ic-ELISA对阳性融合细胞株进行筛选，再采用ic-ELISA对阳性细胞株识别有机磷农药标准物(对硫磷)的能力进行评估。其中，抑制孔中对硫磷浓度为500.00 ng/mL。采用有限稀释法制备稳定分泌特异性抗体的细胞株。

抗体制备：选取5只小鼠，注射无菌石蜡油7 d后，将上述试验中筛选出的细胞株注射入其腹腔，制备腹水。约1周后，当小鼠腹腔部位明显膨大时可收集腹水，间隔3～4 d抽取第二次，重复3～4次。抽取的腹水静置4 h，离心取上清，饱和硫酸铵法[26]纯化，去离子水透析，冷冻干燥，即制得纯化单克隆抗体。

A：半抗原；B：完全抗原A：Hapten；B：Complete antigen图1 合成的半抗原和完全抗原结构Fig.1 Structures of synthesized hapten and complete antigen

1.4 ic-ELISA开发

1.4.1 抗原与抗体最佳工作浓度组合筛选采用ic-ELISA棋盘格试验，即在492 nm下测定吸光值(OD492nm)，筛选零孔的OD492nm在1.00以上、抑制孔的抑制率高于90%时包被抗原与抗体的工作浓度组合。

1.4.2 标准曲线的建立采用ic-ELISA分析不同对硫磷浓度下抗原与抗体的结合率(B/B0)，并建立对应的标准曲线。

1.4.3 ic-ELISA特异性分析在相同工作条件下，建立蝇毒磷、喹硫磷、甲拌磷、甲基对硫磷和倍硫磷的标准曲线，并计算交叉反应率，用于评估所制得单克隆抗体对有机磷农药的识别广谱性。

交叉反应率(%)= IC50(对硫磷)/IC50(有机磷农药)×100

1.4.4 ic-ELISA准确性评估为考察不同浓度基质对ic-ELISA准确性的影响，取空白水果样品，参考NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》的方法进行前处理。提取样品基质后氮气吹干，用PBS将其稀释1、5、10和20倍，并用不同浓度基质将喹硫磷标准品分别稀释为4个标准浓度(0.05、0.10、0.20和0.40 μg/mL)后进行添加回收试验。筛选对ic-ELISA性能影响最小的稀释倍数，在柑橘和鲜橙样品中进行验证，同时采用NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》中的GC进行平行测定。

图2 人工抗原DPPs-BSA(A)和DPPs-OVA(B)的紫外吸收图Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of artificial antigens DPPs-BSA(A) and DPPs-OVA(B)

1.5 统计分析

试验数据采用SPSS 19.0进行方差分析和多重比较。标准曲线拟合及IC20、IC50和IC80等参数采用GraphPad Prism 7进行计算。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的鉴定结果

从图2可看出，合成半抗原Hapten-DPPs、BSA和OVA的最大吸收峰分别在272、285和287 nm处，与免疫抗原DPPs-BSA和包被抗原DPPs-OVA存在明显差异，且与各自的载体蛋白相比，在272～287 nm区间范围的吸收峰明显不同，说明抗原偶联成功。

2.2 融合小鼠的筛选结果

由表2可知，在融合试验前4 d，综合考虑最佳稀释倍数需对照孔的OD492nm较高，且同时抑制孔有较高的抑制率，包被抗原DPPs-OVA(1.0 mg/mL)稀释500倍、血清稀释4000倍时为建立标准曲线的最佳抗原抗体工作浓度组合。以500倍稀释抗原和4000倍稀释血清为条件开展下一步试验。

2.3 单克隆抗体的制备结果

细胞融合后，采用ic-ELISA对阳性细胞孔和抗性细胞孔进行筛选。有4个杂交瘤细胞融合孔表现出较强的阳性及对对硫磷的抗性(表3)，采用有限稀释法对多次克隆进行筛选，以抑制率为筛选标准，选取效价较高的杂交瘤细胞株系，经多次筛选，获得4株效价较高、特异性较强的单克隆杂交瘤细胞株，其抑制率分布在59%～93%，其中特异性最强的细胞株为5G8，将其扩大培养后用腹水法制备抗体。

表2 对硫磷对融合小鼠抗血清抑制反应的检测结果

表3 筛选所获杂交瘤细胞株的阳性及抑制效率检测结果

2.4 抗原和抗体工作浓度的优化结果

包被抗原与抗体的配合效果会对ic-ELISA的灵敏度产生影响，故需对其配合的工作浓度进行优化。由表4可知，抑制率随着包被抗原与抗体稀释倍数提高表现出先升后降的变化趋势。当包被抗原DPPs-OVA以1∶2000(0.5 μg/mL)、抗体以1∶1000稀释(1.0 μg/mL)时，达到峰值对照孔的吸光值OD492nm≥1.00，且抑制孔的抑制率≥90.00%，故以0.5 μg/mL包被抗原与1.0 μg/mL抗体浓度组合建立标准曲线。

2.5 对硫磷ic-ELSA标准曲线的建立

从拟合得到的标准曲线(图3)可看出，细胞株5G8所分泌抗体(单克隆抗体5G82D5)的IC50为41.78 ng/mL，ic-ELISA检测范围(IC20～IC80)位于3.21～239.59 ng/mL，相关系数为0.9999。说明该抗体可在一定范围内与有机磷农药分子特异性结合，且具有较宽的线性范围，可用于ic-ELISA开发。

2.6 抗体的广谱性分析结果

选取6种有机磷类化合物标准物(对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷、甲拌磷、甲基对硫磷和倍硫磷)，评价所构建的ic-ELISA对有机磷农药识别的广谱性。由表5可知，单克隆抗体5G82D5与有机磷农药均存在不同程度的交叉反应，交叉反应率为0.70%～19.79%，其中，与喹硫磷的交叉反应率最强，IC50仅为221.12 ng/mL，而与倍硫磷和甲拌磷的交叉反应率较弱，IC50分别为5953.06和4913.91 ng/mL，说明该单克隆抗体可用多种有机磷农药广谱筛选的ic-ELISA开发。根据GB 2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》的规定可知，该抗体对喹硫磷的检测范围可满足水果(柑橘类)中喹硫磷的最大残留限量要求，因此后续开展该抗体应用于喹硫磷的ic-ELISA开发研究。

图3 ic-ELISA检测对硫磷的标准曲线Fig.3 Standard inhibition curve of parathion in ic-ELISA detection

2.7 喹硫磷添加回收试验结果

由表6可知，以柑橘为基质，在5×稀释倍数下的喹硫磷添加回收率为100.18%～116.08%，以鲜橙为基质时，在5×稀释倍数下的喹硫磷添加回收率为71.38%～88.84%，二者的喹硫磷添加回收率误差均小于20.00%，而在10×和16×稀释倍数下的喹硫磷添加回收率误差均大于20.00%。可见，在不同基质背景下，将基质缓冲液的目标稀释倍数设定为5×为最佳稀释倍数。

ic-ELISA与GC 2种方法交叉验证结果(表7)表明，柑橘中ic-ELISA的加标回收率为102.35%～107.53%，GC的加标回收率为93.30%～93.90%；鲜橙中ic-ELISA的加标回收率为94.09%～97.30%，GC的加标回收率为100.80%～101.10%。可见，2种方法检测结果的一致性较好，说明建立的喹硫磷ic-ELISA准确度较高。

表4 抗原和抗体最佳工作浓度筛选结果

表5 单克隆抗体5G82D5交叉反应评价结果

表6 柑橘和鲜橙样品的喹硫磷添加回收试验结果

3 讨论

目前，关于农药多残留免疫检测方法的建立已有较多报道。Jang等[27]建立识别4种有机磷农药的ELISA方法，其IC50介于100.00～300.00 ng/mL。Liu等[28]开发的抗体可对6种有机磷农药进行ELISA检定，但灵敏度较低。Piao等[29]建立可监测12种农药的ELISA，其IC50最低为2.00 ng/mL，已具备较好的检测广谱性和灵敏度。Wang等[30]开发4种有机磷农药的ELISA，其IC50最低为20.32 ng/mL。针对相关抗体的应用研究也有报道，如Jiang等[31]基于ELISA结合磁珠技术实现对敌百虫、草甘膦和马拉松3种有机磷农药多残留的快速检测，检测限分别达72.20、88.80和195.37 ng/mL。

现有的农药残留监测结果表明，蔬菜的有机磷农药残留已向多残留发展[32-33]。本研究通过合成半抗原4-(二乙氧基硫代磷酰氧基)-肉桂酸，将其与载体蛋白偶联制备完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合及系列筛选过程获得能识别DPPs药效官能团硫代磷酸二乙酯的宽谱型抗体，建立对DPPs的多残留免疫分析方法，通过分析对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷、甲拌磷、甲基对硫磷和倍硫磷6种DPPs的交叉反应情况，评价抗体5G82D5的宽谱性，结果发现该抗体具备对6种有机磷农药的初筛能力，其中，蝇毒磷、喹硫磷和倍硫磷未出现在现行国标快速检测方法GB/T 18630—2002《蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法酶抑制法》和GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》可检指标中，但对对硫磷的定量监测能力远优于国标法的检出能力；抗体对对硫磷和喹硫磷具有较强的识别效率，其IC50分别为41.78和211.12 ng/mL，依据国家标准GB 2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中的农药最大残留限量(MRL)，本研究建立的ic-ELISA基本能满足该2种DPPs农药在果蔬中的检测要求，可用于对硫磷和喹硫磷快速筛查技术开发及相关定性分析技术研究。

表7 ic-ELISA和GC法添加回收试验结果

对硫磷和喹硫磷的结构均与免疫原相似，可能更有利于分子间作用力及抗体识别区结合界面形成，因此具有较高的识别效率[34]。在本研究的6种DPPs中，抗体对甲基对硫磷的识别效率最低，IC50为5953.06 ng/mL，推测芳香环在抗体与农药的识别过程中发挥了重要作用[34]。采用4-(二乙氧基硫代磷酸酯基)苯甲酸[4-(diethoxyphosphorothioyloxy) benzoic acid]可构建对硫磷高特异性抗原，本研究在此基础上，于苯环与其他官能团连接处增加一个二酯键结构，提高了所构建抗体的广谱识别率，但其中的作用机制仍需进一步探究。周丽君等[35]研究指出，在检测灵敏度方面，基于单链抗体scFv的ELISA对所有DPPs的IC50均低于基于单克隆抗体的ELISA结果，说明与亲本单克隆抗体相比，所获得的scFv对二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药检测的灵敏度整体上会有所改善。因此，开发5G82D5抗体的scFv抗体，可进一步提高其对对硫磷和喹硫磷的识别筛选能力。