宁夏地区不同品系番茄主要病毒病种类鉴定及复合侵染研究

2022-02-08马晓春李建设高艳明柴阿丽王晓敏闫海静王嘉欣

西南农业学报 2022年11期

马晓春，李建设，高艳明，柴阿丽，王晓敏，闫海静，王嘉欣

(1.宁夏大学农学院，银川 750021；2. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

【研究意义】随着番茄(Solanumlycopersicum)种植面积的增加以及贸易往来日趋频繁，番茄病毒病也随之加重。番茄病毒病具有较强的爆发性和毁灭性，在我国的各个番茄主栽区频繁发生，对我国的番茄产业造成较大冲击。因此，明确侵染我国各个地区的番茄病毒病种类，筛选适宜各地抗病毒品种，对预防番茄病毒病的发生以及减轻病毒病对番茄产业带来的危害意义重大。【前人研究进展】番茄病毒症状分为花叶型、蕨叶型、条斑型以及黄色花叶型[1]。目前，国内外报道的可侵染番茄的病毒至少有136种[2]，且35种番茄病毒在我国已报道，包括23种RNA病毒和11种DNA病毒[3-4]。其中番茄黄化曲叶病毒病(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，DNA病毒。TYLCV于20世纪30年代末在以色列首次发现[5]，于2006年在我国首次检出[6]，随着媒介烟粉虱在全国范围内暴发，在我国番茄主产区以从南到北的趋势扩展开来[7]，造成番茄大面积减产甚至绝产。此外，宁夏于2011年在贺兰县首次发现TYLCV，随后该病毒向全宁夏区域蔓延[8]。番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)属长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)，单链RNA病毒。1998年，ToCV在美国佛罗里达州被首次发现并报道，之后在全球30多个国家陆续报道[9]。ToCV于2004年在我国台湾首次报道，现已扩散至河北、广东、天津等多个省份[10-11]。被ToCV侵染后的植株表现出严重的褪绿和黄化，极似营养失调症，曾被人们一度认为是植株营养生理失调或农药药害所致，因此常因误判而不能够及时准确防治[12-15]。番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)属番茄斑萎病毒科(Tospovirus)，番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)，RNA病毒。TSWV于1915年在澳大利亚被首次报道[16]，现已流行于世界各地。1989年，自我国首次在广州报道TSWV以来[17]，在我国南北方地区包括云南、宁夏等地亦大面积发生[18-19]，成为制约番茄产业发展的又一重要病害。TSWV的主要传播媒介为西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)[20]。受不同环境、不同番茄品种以及栽培管理和农事操作等因素的影响，不同地区的番茄病毒种类不同[21]。【本研究切入点】番茄病毒病危害不断加重，目前针对番茄病毒复合侵染的相关报道较少，缺少对宁夏地区番茄主要病毒种类的系统研究。【拟解决的关键问题】本研究在宁夏银川周边进行田间调查，利用分子检测鉴定手段，从田间采集不同品种疑似番茄病毒样本，进一步确定宁夏地区侵染番茄的主要病毒种类以及复合侵染的类型，旨在为宁夏设施栽培番茄筛选出较好的抗性品种，以及为田间生产指导提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试番茄品种

供试番茄品种于2021年6月29日和7月15日采用穴盘育苗方式在宁夏贺兰园艺产业园植物工厂播种，待幼苗生长至3叶1心时定植，‘盛世1号’‘澳粉1号’‘施华洛’‘美粉969’‘丰收’‘丰冠’‘京采6号’‘伊亚’共8个大果番茄品种于2021年7月21日在产业园2号、13号日光温室内定植，‘TY1602’‘普罗旺斯’‘京番308’‘甜脆脆’‘1号’‘味多美2号’‘原味1号’‘亚蔬12号’‘樱桃番茄香妃9号’‘阿鲁’于2021年8月7日在玻璃温室定植。

1.2 试验场地描述

日光温室每个品种定植38～39株，株行距42.0 cm×75.0 cm；玻璃温室每个品种定植50株，株行距20.0 cm×80.0 cm。定植前安装滴灌系统，并用利尔康(泡腾消毒片Ⅱ型)对基质土壤进行消毒，定植时每棵番茄苗穴施1 g 5%的噻虫嗪颗粒剂，定植后按常规方法施肥和管理，番茄均采用单杆整枝。

1.3 待测番茄样品采集

2021年9月8日在宁夏贺兰园艺产业园2号、13号日光温室(2号温室为基质培，13号温室为土培)和A3玻璃温室对大红番茄、粉果番茄和樱桃番茄植株进行田间调查，并分别采集18个番茄品种共366份疑似发病植株叶片，拍照后分别装在采集袋中，标明采集时间、地点、品种、症状，带回实验室，次日进行病毒病鉴定，剩余样品标记后存入-80 ℃保存备用。样品采集时温室内番茄病毒病均自然发病，取样期间不使用任何化学农药。

表1 引物序列信息

1.4 番茄病样总DNA/RNA提取

1.4.1 番茄叶片总DNA提取称取0.1 g番茄叶片样品，加入液氮充分研磨成粉末，采用Tiangen DNA提取试剂盒，按照操作说明提取DNA，用于后续试验。

1.4.2 番茄总RNA的提取及cDNA的合成称取0.1 g番茄叶片样品，加入液氮充分研磨成粉末，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒，按照操作说明进行提取RNA，反转录采用Vazyme生物公司的 Hiscript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)，以提取的总RNA为模板进行反转录，反应体系和步骤参照Vazyme生物公司产品说明书进行。cDNA合成：加入2 μL RNA，用RNase Free ddH2O补足到8 μL，65 ℃加热5 min，迅速置于冰上骤冷，静置2 min；然后加入5×gDNA wiper Mix 2 μL，用移液器轻轻吹打混匀，42 ℃ 2 min；第一链cDNA合成反应：10 μL 2×RT Mix，2 μL Hiscript Ⅲ Enzyme Mix，1 μL Radom hexamers，RNase Free ddH2O 25 ℃ 5 min，37 ℃ 45 min，85 ℃ 5 s，-20 ℃保存备用。

1.5 不同品种番茄病样RT-PCR检测

1.5.1 常规PCR检测利用TYLCV特异性引物(表1)按照说明书进行常规PCR扩增，扩增体系(20 μL)：2×TaqMaster Mix (Dye Plus)10 μL，TYLCV-F/TYLCV-R引物各0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 7 μL 。扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，34个循环；最后72 ℃延伸10 min，-20 ℃保存。

1.5.2 RT-PCR检测分别利用特异性引物(表1)按照说明书步骤进行RT-PCR扩增，扩增体系(20 μL)：2×TaqMaster Mix(Dye Plus) 10 μL，ToCV-F/ToCV-R、TSWV-F/TSWV-R、STV-F/STV-R引物各0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 7 μL 。扩增条件同PCR扩增。扩增结束后，分别取5 μL PCR/RT-PCR 产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测，并用全自动凝胶成像系统记录结果。

1.6 不同品种番茄抗病性鉴定

参照许向阳等[22]的方法，调查每株番茄的发病情况，计算病株率并根据分级方法评估抗性等级，分别予以记录。

病株率(%)=病株数/调查总株×100

病情指数=Σ(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高严重度代表值)×100

分级标准。免疫：病情指数为0，植株不带毒；高抗：0<病情指数≤ 2；抗病：2<病情指数< 15；耐病：15<病情指数< 30；感病：病情指数>30。

2 结果与分析

2.1 番茄的田间症状

宁夏保护地栽培番茄在夏季和秋季病毒病发生十分严重，主要发病症状表现为开花期植株顶端叶片黄化，叶脉明显但叶肉发黄，心叶畸形、褶皱，叶边缘卷曲变形，叶背面叶脉变粗，植株矮化(图1-A)；部分植株表现为上部叶片缩小微卷，生长点坏死，部分叶片黄化，有些叶片除了主叶脉其余部分均出现黑色斑块，有的叶柄也可见较浅黑色条斑(图1-B)；另外，植株表现为顶端叶片黄化、白化、褪绿，植株长势衰弱(图1-C)；有些植株同时表现为顶部叶片黄化、卷曲、皱缩，叶面凹凸不平，叶边缘辐射至叶脉处出现古铜色斑点或斑块(图1-D)；除此之外，有些番茄植株呈丛生状，植株近一半表现出心叶叶片严重黄化卷曲，叶片变硬变脆，节间缩短，叶片甚至干枯脱落，茎秆的支撑力减弱，植株生长停滞(图1-E)；植株生长至结果期，前期发病的植株仍表现出上部叶片黄化卷曲，底部叶片叶肉褪绿变紫，此症状逐渐向上部发展，且果实较健康植株小(图1-F)。说明，宁夏番茄无土栽培田间病毒病整体发生严重且呈暴发趋势，且在番茄不同品种间、不同生育期发病程度均表现不一，因此，番茄病毒病不仅仅有单一侵染，同时，复合侵染的情况也较多。

图1 番茄病样田间症状Fig.1 Field symptoms of tomato disease

2.2 番茄病样RT-PCR鉴定分析

利用TYLCV、ToCV、TSWV、STV、ToMV、CMV和TMV特异性引物对采自田间的366份番茄疑似病样进行PCR/RT-PCR检测，结果表明，所检测样本的特异性引物TYLCV-F/TYLCV-R、ToCV-F/ToCV-R、TSWV-F/TSWV-R和STV-F/STV-R在相应处均扩增出648、450、425、681 bp的单一条带。而ToMV、CMV、TMV和阴性对照未能扩增出目的条带。4个目的条带亮度有所差异，尤其与ToCV病毒所对应的条带较其他微弱，考虑到4种病毒存在营养和空间的竞争。另外，通过田间调查不同品种番茄感病症状，选取宁夏贺兰园艺产业园主栽品种‘TY1602’的病叶再次提取总RNA/DNA，并利用已经检测出的病毒种类的特异性引物进行RT-PCR检测，结果显示所对应特异性引物均扩增出450、425、681和648 bp大小的特异性条带(图2)，与预期目的条带大小相符。说明，番茄品种‘TY1602’同时被TYLCV、ToCV、TSWV和STV侵染。

2.3 不同品种番茄病毒病复合侵染分析

从表2可看出，病毒病复合侵染情况在产业园普遍发生，且在不同品种间和不同栽培基质间均表现出差异。检测结果显示，有单一病毒侵染的品种，也有2种病毒复合侵染的样品，部分品种同时被3种病毒所侵染。此外，检测发现，有的品种植株样本检测出4种病毒的存在。

产业园2号温室和13号温室主要品种为大果硬果番茄，主要表现出2种病毒复合侵染的症状，而A3玻璃温室主栽品种为水果番茄和樱桃番茄，病毒病发生较2号和13号温室严重且侵染的病毒种类为2种或2种以上，其中以3种复合侵染为主。另外，3个温室中的番茄品种无论抗TYLCV与否，都检出TYLCV病毒，检出率为100%；4种病毒在不同结构温室均有发生，除感染TYLCV病毒外，ToCV和STV在不同温室也普遍分布；此外，玻璃温室的番茄样本大多可检测到TSWV病毒。在18种番茄品种中，单一病毒侵染的品种有硬果番茄‘盛世1号’和樱桃番茄‘香妃9号’，这2个品种在田间相较于其他品种长势较好；其他品种均存在复合侵染。从检测结果中同样可得出，TYLCV病毒单一侵染占采集总样本的10.38%；复合侵染样本数为328份，占比为81.69%，2种病毒复合侵染占总复合侵染的72.95%，其中占比较多的是TYLCV+ToCV病毒，复合侵染率占40.44%，TYLCV+STV病毒复合侵染以及TYLCV+TSWV病毒复合侵染分别占22.68%和6.01%；3种病毒复合侵染占总复合侵染的8.47%，侵染类型有TYLCV+ToCV+STV、TYLCV+ToCV+TSWV、TYLCV+STV+TSWV，其中TYLCV+ToCV+STV、TYLCV+ToCV+TSWV复合侵染情况相当，分别占总侵染率的3.83%和3.28%，另外，占比较少的侵染类型为TYLCV+STV+TSWV；4种病毒复合侵染占总复合侵染样本的0.27%，为TYLCV+ToCV+STV+TSWV。可见，番茄病毒病复合侵染现象已在该园区大面积发生。

M.分子质量标准 DL5000 DNA Marker；1. 番茄褪绿病毒；2. 番茄斑萎病毒；3. 南方番茄病毒；4. 番茄黄化曲叶病毒；5. 番茄花叶病毒；6. 黄瓜花叶病毒；7. 烟草花叶病毒；8～10.阴性对照M. Molecular mass standard DL5000 DNA Marker; 1. TSWV; 2. ToCV; 3. STV; 4. TYLCV; 5. ToMV; 6. CMV; 7. TMV; 8-10. Negative control图2 部分番茄样品的PCR检测凝胶电泳结果Fig.2 PCR detection GEL electrophoresis results of some tomato samples

表2 不同品种番茄病毒病检测鉴定

2.4 不同品系番茄病毒病抗性分析

不同番茄品种对病毒病的抗性表现不同(表3)，在所有品系番茄中，除‘丰冠’为感病品种外，其他品系番茄都表现出不同程度的抗性。其中，硬果番茄‘丰收’，口感番茄‘京采6号’‘1号’以及樱桃番茄‘阿鲁’和‘香妃9号’表现为高抗水平；抗性等级为抗病的品种有‘盛世1号’‘澳粉1号’‘施华洛’‘伊亚’‘美粉969’‘TY1602’‘普罗旺斯’‘亚蔬12号’‘甜脆脆’‘原味1号’‘京番308’‘味多美2号’，这几个品种的病情指数最高，达到14.0，其中‘澳粉1号’的病指最低，为2.3。高抗品种占参试总品种的27.78%，而大多数为抗性品系，占总品系的66.67%。

3 讨论

本研究利用分子技术手段，对采自宁夏贺兰园艺产业园疑似感染病毒的番茄植株样品进行RT-PCR检测，鉴定出4种病毒，分别为TYLCV、ToCV、STV和TSWV。检测分析显示，采集的366份样本中，TYLCV检出率为100%，而且TY抗性品种部分感染了TYLCV病毒，这可能是棚室温度高于35 ℃，抗TY品种抗性减弱所致，也有可能是由于TYLCV拥有单链DNA病毒容易变异的属性，导致抗性不稳定[23]。另外，被ToCV和STV侵染的样本，分别占总采集样本的40.44%和22.68%。其中，以烟粉虱为主要传播媒介的病毒TYLCV和ToCV，自被宁夏报道[8,24]以来，已发展为该地区的优势病毒种类。凡是我国番茄主栽区，TYLCV和ToCV同样为侵染番茄的主要病原[21]。高温和干旱是病毒病发病的有利条件，粉虱的发生情况与病毒的发生呈正相关关系[25]。因为采样时期(8、9月)正值烟粉虱高发季，加之今年夏季整体温度较高，降雨少，棚室内粉虱大量聚集，为粉虱的发生和繁殖创造了有利条件。除此之外，番茄发病程度与其发育阶段也有密切联系[26]，采样地区番茄定植时期为7、8月，没有避开番茄易感病期，且遇粉虱高发期，因此出现大面积侵染TYLCV和ToCV。

表3 不同品系番茄病毒病抗性评价

自然条件下，出现2种或2种以上病毒复合侵染植物的情况已司空见惯，当不同病毒复合侵染时，作物更多表现出协生作用[27]。本研究发现，宁夏地区番茄复合侵染现象已不足为奇，复合侵染的样本占总样本数量的81.69%，复合侵染形式以TYLCV与ToCV、STV以及TSWV复合侵染为主，其中2种病毒复合侵染占多数，且TYLCV和ToCV病毒复合侵染为样本采集地区的侵染优势种，占总复合侵染率的40.44%。我国山东[28]、云南[29]、江苏[30]、河南[31]、河北[32]等多个地区也有TYLCV和ToCV复合侵染的相关报道[33]，这可能是由于昆虫获毒、传毒效率与病毒互作所致[34]，也有可能是感染其中一种病毒的植株失去抵御另外一种病毒的能力。另外，本研究检测到ToCV与TSWV病毒复合侵染，这是因为2种病毒之间存在协生作用[35]。除此以外，也检测到STV与TYLCV、ToCV、TSWV其中的1种甚至2种或3种复合侵染。研究指出，STV通常与其他病毒复合感染，在山东，有STV与TYLCV、CMV、TOCV复合侵染的报道[36]；新疆出现STV、CMV、PVY、ToMV复合侵染的现象[37]；北京也检测到STV与TYLCV、ToCV复合侵染[38]。可见，种传病毒STV不容小觑，应引起重视。

通过田间病毒病发生情况调查以及分子检测发现，本研究所有参试品种中，大果红果早熟番茄‘丰收’和樱桃番茄‘阿鲁’表现出高抗番茄病毒病，且在田间长势良好，植株总体健康，其次为粉果番茄‘澳粉1号’‘京采6号’和鲜食番茄‘1号’‘亚蔬12号’‘原味1号’，这几个品种在田间总体表现良好，并且病毒侵染率也较其他品种低。‘丰冠’‘味多美2号’‘京番308’植株病毒侵染率高达74%～78%。就目前的抗病毒品种而言，学者们通过不同方法选育了一些抗性较高的品种。邵秀丽等[39]将‘牟番38’进行了不同区域和不同茬次种植，进行植物学性状评价和田间抗病性评估，得出此品种田间抗番茄TY病毒病；帕提古丽·艾斯木托拉等[40]通过抗病性、植株生物学、果实品质和产量综合分析，筛选出‘欧瑞斯’‘奥力奥’‘新达利’优质品种。另外，李亚茹等[41]提出对抗性表现较好的基因采用聚合育种，从而提高品种抗性能力。

初步判定‘丰收’‘阿鲁’‘澳粉1号’‘京采6号’‘1号’‘亚蔬12号’‘原味1号’这几个品种为抗病毒品种，但缺少品种与多种病毒靶标对峙抗性，后期可进一步验证抗病毒品种。此次在宁夏采样范围和采样时间均有局限，检测到的病毒种类并不完全，下一步可在不同时间段对宁夏地区各市县进行番茄病毒病调查以及采样鉴定，为宁夏番茄产业提供理论依据和技术指导。