LC-MS/MS法测定麻黄-桂枝药对中11个成分及其溶出影响的探讨

卫平，邓小玉，黄蓓，陈剑平，李一圣

(1.深圳市坪山区妇幼保健院<南方医科大学坪山总医院>，广东 深圳 518118；2.深圳市中医院，深圳市医院中药制剂研究重点实验室，广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518033；3.深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院<深圳市耳鼻咽喉研究所>，广东 深圳 518172)

麻黄为麻黄科植物草麻黄(EphedrasinicaStapf)、中麻黄(EphedraintermediaSchrenk et C.A.Mey.)或木贼麻黄(EphedraequisetinaBge.)的干燥草质茎，具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿的功效[1]。桂枝为樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl.)的干燥嫩枝，具有散寒解表、温通经脉、促阳化气之功[1]。麻黄-桂枝药对出自《伤寒论》，在麻黄汤、大青龙汤等诸多经典方剂中常作为君药、臣药应用。现代研究表明[2-5]，麻黄中生物碱类、苯丙素类等成分对感冒、咳嗽、心血管和免疫系统疾病等具有治疗作用；桂枝中苯丙素类具有解热镇痛、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗血小板聚集等作用。桂枝与麻黄配伍后，解热镇痛、抗炎作用增强，不仅如此，桂枝、麻黄配伍后能提高生物利用度，桂枝能拮抗麻黄引起的兴奋性中枢神经毒性，降低了麻黄生物碱的蓄积，起到减毒的作用[6-8]。

药对是中药配伍应用的重要模式，常作为药物组成方剂的核心，具备复方的基本功能主治和疗效[9]。中药配伍使用后产生助溶、沉淀、化学反应等现象，以及煎煮等因素的影响，有效成分溶出率发生变化，对临床疗效也可产生影响[10-11]。近年来，关于中药配方颗粒(以单味中药饮片为原料精制而成)“单煎合同”与传统汤剂“群药合煎”的物质基础一致性一直是大众比较关注的问题[12-13]。本试验建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定8个苯丙素类成分(原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛)和3个麻黄类生物碱(麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱)的含量，考察麻黄桂枝共煎、单煎及单煎合并液中11个成分的变化，以期探索共煎及单煎合并对其主要成分的溶出影响，为该药对的配伍物质基础及临床应用研究提供试验数据。

1 材料

1.1 仪器 岛津LC-MS8045型液质联用仪(岛津公司，配备DGU-20A3R在线脱气机，LC-20ADXR梯度泵、SIL-20AXR自动进样器，CTO-20A柱温箱，LCMS-8 045检测器，CBM-20A系统控制器，FCV-20AH2高压切换阀，LabSolutions色谱工作站)；EP225SM-DR型十万分之一分析天平(瑞士普利塞斯公司)；A3S-10-10-CE型超纯水机(美国艾科浦公司)；LD5-2A型离心机(北京京立离心机有限公司)；KQ5200DE数控超声波清洗器(昆山市超室仪器有限公司)；手动移液器(Eppendorf公司)。

1.2 药物与试剂 麻黄饮片(康美药业股份有限公司，批号：201000051)；桂枝饮片(中山市正德香中药饮片有限公司，批号：202011068)，经深圳市医院中药制剂研究重点实验室陈剑平副主任中药师鉴定，分别为麻黄科草本状小灌木草麻黄(EphedrasinicaStapf.)的草质茎和樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl.)的干燥嫩枝，符合《中国药典》2020年版(一部)项下规定；其中麻黄产自内蒙古，桂枝产自广东。

肉桂酸(批号：110786-201604，98.8%)、桂皮醛(批号：110710-202022，99.5%)、儿茶素(批号：110877-20164，99.2%)、表儿茶素(批号：110878-201703，99.7%)、原儿茶酸(批号：110809-201906，97.7%)、盐酸麻黄碱(批号：171241-201809，100.0%)、盐酸伪麻黄碱(批号：171237-201510，99.8%)和盐酸甲基麻黄碱(批号：171247-201502，99.6%)购自中国食品药品检定研究院；肉桂醇(批号：wkq21030503，HPLC≥98%)和香豆素(批号：wkq21030 207，HPLC≥98%)购自四川省维克奇生物科技有限公司；丁香醛(广州市齐云生物科技有限公司，批号：200910，HPLC≥98%)；乙腈和甲醇(质谱级，Merck公司);甲酸(质谱级，赛默飞公司);超纯水(由Milli-Q超纯水系统制得)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备 苯丙素类成分：精密称取原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛对照品适量，加入乙腈超声溶解，制成质量浓度分别为0.786 5、1.319 4、1.532 1、0.625 3、1.395 0、1.746 3、0.894 1、5.392 8 mg·mL-1的单一对照品储备液，备用。分别精密量取上述对照品溶液适量，置同一容量瓶中，加入乙腈至刻度，即得原儿茶酸(0.707 4 μg·mL-1)、儿茶素(18.471 6 μg·mL-1)、表儿茶素(15.321 0 μg·mL-1)、丁香醛(0.313 0 μg·mL-1)、香豆素(3.906 0 μg·mL-1)、肉桂醇(8.732 0 μg·mL-1)、肉桂酸(14.305 6 μg·mL-1)、桂皮醛(64.713 6 μg·mL-1)的混合对照品溶液。

麻黄生物碱类：精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、盐酸甲基麻黄碱对照品适量，加入甲醇超声溶解，制成质量浓度分别为2.075 0、1.379 7、1.683 2 mg·mL-1的单一对照品储备液，备用。分别精密量取上述对照品溶液适量，置同一容量瓶中，加入甲醇至刻度，即得麻黄碱(17.928 0 μg·mL-1)、伪麻黄碱(8.828 8 μg·mL-1)、甲基麻黄碱(2.155 5 μg·mL-1)的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 麻黄-桂枝共煎液称取麻黄90 g，加水2 400 mL，浸泡30 min，先煎煮20 min，放入桂枝60 g，继续煎煮30 min，保持微沸，过滤，放冷，定容至2 000 mL，即得。

麻黄单煎液：称取麻黄90 g，加水2 400 mL，浸泡30 min，煎煮50 min，保持微沸，过滤，放冷，定容至2 000 mL，即得。

桂枝单煎液：量取水2 400 mL，煮沸，放入桂枝60 g，继续煎煮30 min，保持微沸，过滤，放冷，定容至2 000 mL，即得。

单煎合并液：分别量取麻黄、桂枝单煎液各1 000 mL，混匀，即得。

供试品溶液：精密量取各煎液1 mL，置于2 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度线，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得以上各供试品溶液。

2.2 色谱条件

2.2.1 苯丙素类成分 色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18柱(4.6 mm×250 mm，3 μm)；流动相：乙腈(A)-0.01%甲酸水溶液(B)，0～20 min，5%→55%(A)；流速：1.0 mL·min-1，分流比为0.4；柱温：30 ℃；进样量：2 μL。

2.2.2 麻黄类生物碱 色谱柱：Waters Xselect HSS T3柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，0～20 min，3%→8%(A)；20～25 min，8%→20%(A)；流速：1.0 mL·min-1，分流比为0.4；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。

2.3 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，多反应监测(MRM)模式，正负离子(苯丙素类生物碱)、正离子(麻黄生物碱类)，雾化气流量为3.0 L·min-1，干燥气流量为10.0 L·min-1，加热气流量为10.0 L·min-1，检测器电压为1.88 kV，检测离子及主要参数见表1。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液，供试品溶液各2 μL，按“2.2”和“2.3”项下色谱及质谱条件进样测定，记录色谱图。结果，各待测成分色谱峰峰形良好且实现基线分离。

2.4.2 线性关系考察 取“2.1.1”项下各单一对照品储备液，用甲醇(麻黄生物碱类)或乙腈(苯丙素类)稀释配制为梯度浓度的混合溶液，按照“2.2”和“2.3”项下条件进行测定，以质量浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，得回归方程，结果见表2。

2.4.3 精密度试验 取“2.1.2”项下的供试品溶液，按“2.2”和“2.3”项下条件进样测定，记录峰面积并计算RSD。结果，原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱的RSD(n=6)分别为2.24%、3.15%、2.50%、3.27%、1.68%、2.42%、2.21%、1.50%、2.51%、2.64%、0.80%，均小于5.0%，表明本方法的精密度良好。

表1 各成分质谱检测参数

2.4.4 稳定性试验 取“2.1.2”项下的供试品溶液，按“2.2”和“2.3”项下条件分别于0、4、8、12、16、24 h进样测定，记录峰面积并计算RSD。结果，原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱的RSD(n=5)分别为、6.78%、4.69%、6.24%、3.35%、3.19%、5.75%、1.63%、4.28%、3.33%、2.99%、4.60%，均小于5.0%，表明供试品溶液在室温放置24h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.2”和“2.3”项下条件进样测定，测定含量并计算RSD。结果，原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱的平均含量分别为1.125 1、38.375 5、25.131 1、0.711 0、9.112 0、17.873 8、23.327 1、111.025 4、165.616 0、76.082 5、18.163 0 μg·mL-1，RSD(n=6)分别为3.89%、3.54%、2.79%、4.64%、1.44%、1.92%、1.61%、1.81%、0.83%、1.32%、1.42%，均小于5.0%，表明本方法的重复性良好。

2.4.6 加样回收试验 取9份已知含量的样品0.5 mL，按质量比0.5∶1、1∶1、1.5∶1加入各对照品适量，平行3份，按“2.1.2”项下方法制得供试品溶液，并按“2.2”和“2.3”项下条件进样测定，计算加样回收率。结果，原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱的加样回收率分别为99.03%、100.38%、98.27%、100.92%、100.12%、96.76%、98.60%、102.18%、99.57%、101.77%、100.86%，RSD(n=9)分别为5.19%、2.55%、4.81%、4.65%、3.38%、1.40%、3.65%、1.97%、5.19%、2.55%、4.81%。

表2 11个成分的标准曲线方程和线性范围

2.5 含量测定 按“2.1.2”项下方法制得各批次供试品溶液(平行5份)，按“2.2”和“2.3”项下条件进样测定。记录峰面积根据标准曲线方程及定容体积折算等计算出麻黄-桂枝共煎液、麻黄单煎液、桂枝单煎液和单煎合并液中原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、丁香醛、香豆素、肉桂酸、肉桂醇、肉桂醛、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱的含量，结果见表3。

表3 含量测定结果

由表3可知，与单煎合并液相比，麻黄与桂枝共煎后，原儿茶酸、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸和桂皮醛的含量均有不同程度的下降，降幅为11.69%～38.63%；另原儿茶酸、肉桂酸单煎合并后与各自单煎液测定结果的和无显著性差异，香豆素、肉桂醇和桂皮醛单煎合并后与各自单煎液测定结果的和以及桂枝单煎液无显著性差异。说明以上溶液在混合时，温度对以上成分的溶出存在一定的影响作用。与单煎合并液相比，麻黄与桂枝共煎后，儿茶素的含量有很大程度的增高，增幅为37.94%，而表儿茶素的含量则无明显的变化。不管是单煎合并还是共煎，丁香醛、儿茶素和表儿茶素的含量比麻黄桂枝各自单煎液测定值的和均有所下降，表明麻黄与桂枝合并使用均降低该3种成分的含量。与单煎合并液相比，麻黄与桂枝共煎后，麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱的含量均有不同程度的增高，增幅为18.84%～41.10%。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 本研究曾尝试同时测定苯丙素类和麻黄生物碱类成分，但由于麻黄碱类成分的检测条件为正离子扫描模式，在流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液时，各色谱峰的分离度、峰形均较好，将流动相改为乙腈-水、乙腈-0.01%甲酸水溶液后，各色谱峰均不成峰形，分离度也不理想；而苯丙素类成分中肉桂酸的检测条件为负离子扫描模式，且对流动相体系的pH值敏感，在流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液时，色谱峰检测不到，未有响应值。当流动相更换为乙腈-水溶液时，原儿茶酸、肉桂酸和丁香醛的色谱峰的峰形均不理想；流动相更换为乙腈-1 mmol·L-1乙酸铵水溶液时，桂皮醛的响应值偏低。另外本研究还分别考察了Waters Xselect HSS T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm,3 μm)2种规格色谱柱，采用Waters Xselect HSS T3色谱柱时，原儿茶酸、肉桂酸2个色谱峰的峰形不理想，采用Agilent ZORBAX SB C18色谱柱时，各色谱峰的分离度、峰形均较好，故最终分别建立了苯丙素类成分和麻黄生物碱类成分的测定方法。

由于桂皮醛不稳定，暴露于空气中易发生氧化，本研究曾用甲醇溶解桂皮醛对照品，于常温和4 ℃条件放置一段时间后，纯度均降低，在LC-MS/MS中可明显检出肉桂酸和其他杂质峰。当采用乙腈溶解时，其稳定性较好，24 h内未见有分解现象，因此最终选用乙腈溶解。本课题组前期建立苯丙素类成分的含量测定方法时，分别采用乙腈-水、乙腈-0.01%甲酸水溶液为流动相，丁香醛、原儿茶酸和肉桂酸在乙腈-0.01%甲酸水溶液为流动相时，峰形较好，基线平稳，分离度好，故最终选择乙腈-0.01%甲酸水溶液作为苯丙素类成分测定的流动相。

3.2 溶出影响探讨 与麻黄单煎和桂枝单煎测定结果的加和相比，共煎条件下8种苯丙素类成分的溶出均呈现不同程度的降低，而在单煎合并条件下，除儿茶素、表儿茶素和丁香醛的溶出有降低外，其余5种成分的含量变化无显著性差异。推测在两药煎煮后混合的过程中，温度对8种苯丙素成分的溶出存在一定的影响。与共同煎煮相比，单煎后合并有利于原儿茶酸、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸和桂皮醛的溶出，抑制了儿茶素的溶出，对表儿茶素的溶出则无显著性影响。

麻黄桂枝单煎合并液中麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱的含量相较于单煎液而言，含量下降，推测简单的合并后，麻黄生物碱与苯丙素类酸性成分酸碱反应形成复盐，导致含量降低[14]，而共煎后的麻黄生物碱等含量较麻黄单煎液中的含量有了升高，升幅在8.51%～16.45%；另本研究还对去甲基麻黄碱和去甲基伪麻黄碱进行了测定，测定的色谱条件同其他麻黄生物碱，由于未购买到该两种成分的对照品，暂未进行定量，峰面积结果显示，该两种生物碱的含量变化趋势与以上检测的3种麻黄生物基本一致。推测与桂枝共煎时，虽然与苯丙素类成分形成复盐，但桂枝中的某些成分可能促进生物碱类等成分更多溶出，具体反应途径亟待研究。麻黄和桂枝配伍共煎使用，对苯丙素类成分的溶出有一定的抑制作用，推断可能两者成分中的生物碱类与苯丙素类之间发生化学反应生成了复盐，导致含量降低。

中医不传之密在于量，因此配伍后效应成分的变化对其主治病症有很重要的影响。本研究建立的8种苯丙类成分和3种麻黄生物碱的LC-MS/MS含量检测方法，简便快速，结果准确可靠，重复性好，为其临床应用和开发研究提供参考。