B亚型禽偏肺病毒灭活疫苗对商品肉鸡免疫效果的研究

包媛玲，何锡栋，于蒙蒙，刘 鹏，陶蓉蓉，肖美丽，王素艳，李欣翼，胡守平，刘爱晶，张艳萍，刘长军，祁小乐，王笑梅,3，高玉龙*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽免疫抑制病创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069；2.福建圣泽生物科技发展有限公司，福建 南平 354100；3.扬州大学江苏省动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心，江苏 扬州 225009）

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV）属于副粘病毒科肺病毒亚科偏肺病毒属，为单股不分节段的负链RNA 病毒[1]。自1978 年在南非首次分离到aMPV 以来，其在世界许多国家均有报道[2-3]。根据aMPV 基因组和抗原的不同，可将其分为A、B、C、D 4 个亚型[4-5]。

aMPV 的自然宿主为鸡和火鸡，在雉、鸭、珍珠鸡、鸵鸟、海鸥、麻雀和其它野生迁徙鸟中也存在[6-7]。aMPV 可感染任何日龄的鸡和火鸡，是引起火鸡鼻气管炎和肉鸡肿头综合征的主要病原体。鸡和火鸡感染aMPV 后主要表现为啰音、打喷嚏、流鼻涕，泡沫性结膜炎，眶下窦肿胀以及单侧或双侧眶周和面部肿胀[8]。aMPV 单一感染时鸡的死亡率不高，但易造成传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡支原体、大肠杆菌或其他病原体的继发感染，导致病情加重，死亡率显著升高[9]。因此，aMPV 对养禽业造成的危害不容忽视。

在我国，自沈瑞忠等于1999 年首次在黑龙江某肉种鸡场分离到aMPV 以来，陆续有学者对aMPV 的流行情况进行了调查[10]。血清学调查结果显示，多个地区鸡场aMPV抗体的阳性率高达100.0%[11]。aMPV对鸡的感染无品种差异性，父母代和商品代鸡及多个品种的种鸡均可感染aMPV。病原学调查结果显示，我国鸡群中存在A、B、C 3 种亚型aMPV 的感染。2016年，有研究人员采集江苏、辽宁、河南、山东、河北等地区种鸡的鼻甲骨和鼻粘液经RT-PCR 检测，结果显示，鸡aMPV的阳性率为50.7%，其中蛋鸡与肉种鸡aMPV 的阳性率分别为7.5%和88%。随机对9 个阳性样品G基因序列的分析结果显示，这些样品均为B亚型aMPV（aMPV/B），表明aMPV/B 在我国广泛流行[12]。目前，国外已研制出aMPV 疫苗并在养殖场普遍应用，而我国目前并无批准使用的aMPV疫苗。

本研究团队前期以从我国鸡中分离的aMPV/B LN16 株为种毒[13]，研制出对SPF 鸡具有良好免疫保护效果的aMPV/B 灭活疫苗[14]。为评估该疫苗在商品肉鸡中的应用前景，本研究系统评价了aMPV/B 灭活疫苗对商品肉鸡的免疫保护效果，为肉鸡养殖场禽偏肺病毒病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料aMPV/B 灭活疫苗由本实验室制备并保存。Vero 细胞由本实验室保存。aMPV/B LN16 株由本实验室分离、鉴定并保存[12]。1 日龄肉鸡由福建圣泽生物科技发展有限公司提供。TRIzol试 剂、10×PCR Buffer（Mg2+Plus）、dNTP Mixture、TaqTMHot Start 均购自宝生物工程（大连）有限公司；反转录试剂盒HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR 购自南京诺唯赞有限公司；aMPV ELISA 抗体检测试剂盒购自美国IDEXX 公司。

1.2 实验设计选取3 周龄商品肉鸡，随机分成两组：免疫组（n=10）和阴性对照组（n=10），饲养于负压隔离器中。免疫组鸡采用胸肌注射的方式接种0.5 mL灭活疫苗，阴性对照组鸡经胸肌注射0.5 mL 无菌PBS。首免后3 周加强免疫一次（n=10）。加强免疫后3 周以aMPV/B LN16 株攻毒（5 000 TCID50/只，滴鼻200 μL），然后进行后续试验。

1.3 攻毒后各组鸡临床症状观察及保护率的统计攻毒后1 d～7 d 观察各组鸡的临床症状，并根据公式计算免疫保护率：疫苗保护率=（对照组发病率-接种组发病率）/对照组发病率×100%。

1.4 各组鸡血清抗体水平的ELISA检测首免后1周～6 周采血，分离血清并1∶500 稀释后，利用aMPV ELISA 抗体检测试剂盒检测各组鸡免疫后不同时间（首免后1 周～6 周）血清的抗体水平。

1.5 各组鸡血清中和抗体效价的测定将1.4 中分离的各组鸡血清样品于56 ℃灭活30 min，0.45 μm 滤器过滤，2 倍倍比稀释（22～28）后，与aMPV LN16 株（4 000 TCID50/mL）等体积混合，于37 ℃孵育1 h。将100 μL的混合物加入96 孔板中的Vero 细胞中，每个样品做6 个重复，置37 ℃孵育1 h，更换为1%血清的DMEM 培养基。继续培养并观察细胞病变效应（CPE），连续记录7 d。使用Reed-Muench 方法计算血清中和抗体的效价。

1.6 各组鸡排毒的荧光定量PCR（qPCR）检测采集1.2 中各组鸡攻毒后1 d～7 d 的鼻拭子，溶于600 μL PBS 中，涡旋振荡混匀后300 ×g 离心5 min，取上清（200 μL）用TRIzol 试剂提取总RNA，反转录为cDNA后作为模板，采用文献[13]中aMPV/B 的qPCR 方法分别检测各组鸡的排毒情况。

1.7 各组鸡各脏器组织病理学变化的观察攻毒后9 d 剖杀各组鸡，分别取其鼻甲、气管和肺脏组织样品于10%福尔马林中固定，脱水后常规包埋，制作石蜡切片，HE 染色后经显微镜观察各组鸡各脏器组织的病变情况。

1.8 数据的统计与分析采用GraphPad 软件8.0.2进行数据统计分析，采用双向方差分析各组间的差异性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组鸡攻毒后临床症状的观察及保护率的统计结果aMPV/B 灭活疫苗加强免疫后3 周，以aMPV/B LN16 株攻毒，攻毒后1 d～7 d 观察各组商品肉鸡的临床症状。结果可见，攻毒后第3 d 开始，对照组鸡出现临床症状，主要表现为有混浊或粘稠泡沫样、牵丝状鼻液，个别鸡有鼻痂等，至攻毒后7 d，其临床症状完全消失。免疫组仅有一只鸡出现积压有鼻液的症状。对照组鸡发病率为90.0%，免疫组鸡的发病率为10.0%，经计算，免疫保护率为88.9%。表明该aMPV/B 灭活疫苗能够有效保护商品肉鸡免受B 亚型aMPV 强毒的攻击。

2.2 各组鸡血清抗体水平的ELISA 检测结果商品肉鸡免疫aMPV/B 灭活疫苗后，于首免后不同时间采用ELISA 检测各组鸡血清的抗体水平。结果显示，首免后1 周～6 周，免疫组商品肉鸡血清抗体水平逐渐升高，首免后第2 周其血清抗体阳性率达100%，首免疫后3 周该组鸡血清平均抗体效价为1∶11 846，加强免疫后3 周即首免后6 周该组鸡血清平均抗体效价为1∶36 619。而阴性对照组鸡血清抗体一直呈阴性（图1）。上述结果表明，该aMPV/B 灭活疫苗能够诱导商品肉鸡产生较高水平的aMPV 特异性抗体，且加强免疫后诱导鸡产生的抗体水平高于单次免疫。

图1 aMPV/B灭活疫苗免疫后商品肉鸡血清抗体水平的检测结果Fig.1 Serum antibody levels of commercial broilers immunized with aMPV/B inactivated vaccine

2.3 各组鸡血清中和抗体水平的检测结果采用固定病毒稀释血清的方法检测各组鸡血清中和抗体效价，结果显示，免疫后2 周免疫组鸡血清中和抗体的阳性率为30%，免疫后3 周该组鸡血清中和抗体的阳性率达100%，首免后3 周和加强免疫后3 周（首免后6 周）血清平均中和抗体效价分别为4.7 log2 和6.5 log2（表1）。上述结果表明，该aMPV/B灭活疫苗能够诱导商品肉鸡产生较高水平的中和抗体。

表1 aMPV/B灭活疫苗免疫后商品肉鸡血清中和抗体效价的检测结果Table 1 Serum neutralizing antibody levels of commercial broilers immunized with aMPV/B inactivated vaccine

2.4 各组鸡攻毒后排毒的RT-qPCR检测结果aMPV/B灭活疫苗加强免疫后3 周，以aMPV/B LN16 株攻毒，并采用RT-qPCR的方法检测攻毒后不同时间各组鸡鼻腔拭子中的病毒拷贝数。结果显示，免疫组鸡鼻腔拭子中的病毒拷贝数为2 792 拷贝/200 μL～45 980 拷贝/200 μL；对照组鸡鼻腔拭子中的病毒拷贝数为8 133拷贝/200 μL～238 297拷贝/200 μL，前者较后者降低了64.6%～80.7%。各组鸡在攻毒后7 d的鼻拭子中均未检测到该病毒，且均在攻毒后3 d 两组鸡鼻腔拭子中的病毒拷贝数均最高（图2）。结果表明，该aMPV/B灭活疫苗可以显著降低aMPV/B 强毒攻击后商品肉鸡的排毒水平。

图2 各组鸡攻毒后排毒的RT-qPCR检测结果Fig.2 Virus shedding of commercial broilers after virulent aMPV/B challenge

2.5 各组鸡攻毒后各组织病理学变化的观察以aMPV/B LN16 株攻毒9 d 后剖杀各组鸡，取其各组织制作病理切片。观察结果可见，阴性对照组鸡鼻甲的鼻黏膜固有层有大量炎性细胞浸润；气管粘膜固有层内有少量炎性细胞浸润；肺房壁可见炎性细胞浸润（黑色箭头所指）。而免疫组鸡各组织均未见明显病理变化（图3）。上述结果表明，该aMPV/B 灭活疫苗能够有效预防aMPV/B 强毒攻击后商品肉鸡呼吸器官的病理反应。

图3 各组鸡攻毒后的鼻甲、气管及肺脏病理变化的观察Fig.3 Histopathologic changes of the turbinate trachea and lung of commercial broilers after aMPV/B challenge

3 讨 论

aMPV 在我国鸡中普遍流行，感染鸡表现出呼吸道症状以及眼眶周围窦和眶下窦肿，斜颈等。研究表明，我国肉种鸡和商品代鸡aMPV 抗体的阳性率均较高，且抗体效价及抗体阳性率随着鸡日龄的增长而逐渐升高[11,15]。病原学检测结果显示，肉鸡中以aMPV/B 为主[12-13]。本研究室前期研制了aMPV/B 灭活疫苗，并证实其对SPF 鸡的免疫保护效果良好[14]。本研究进一步评估了该灭活疫苗对商品肉鸡的免疫保护效果，为该灭活疫苗在商品肉鸡养殖场的应用提供参考。

aMPV 主要存在于鸡的鼻甲、气管、喉头等上呼吸道中，主要通过直接或间接接触在鸡群内水平传播[16]。随着鸡体内抗体水平的变化，可能出现aMPV的反复感染。本研究中，与阴性对照组鸡相比，免疫组鸡鼻腔拭子中的病毒拷贝数显著降低，这可能与灭活疫苗刺激机体产生的中和抗体有关，中和抗体可以与病毒颗粒结合从而阻止其进入宿主细胞。另外，本研究在免疫鸡血清中还检测到较高水平的ELESA 抗体。由此表明，该灭活疫苗免疫后可以刺激机体产生较强的体液免疫反应，从而降低排毒，减轻病毒在鸡群内水平传播的风险。

已有研究表明，aMPV 感染鸡后所致疾病的严重程度和死亡率在很大程度上受继发性细菌感染的影响，aMPV 单一感染时，鸡的死亡率不高，若有混合感染，其死亡率可高达25%～40%[17]。本研究鸡的免疫攻毒结果显示，免疫组鸡的呼吸道（鼻甲、气管）黏膜均未见明显的病理变化，上呼吸道黏膜的完整性能够确保机体的第一道防线不被破坏，因而灭活疫苗阻断了aMPV 及其他病原体的侵入，降低了继发感染的可能性。

本研究采用的免疫程序为3 周龄首免，6 周龄加强免疫，血清抗体检测结果显示，单次免疫后3 周及加强免疫后3 周，免疫组鸡平均抗体效价分别为1∶11846 和1∶36619。与以往制备的aMPV疫苗免疫鸡后未能检测到中和抗体不同[18]，本研究研制的aMPV/B 疫苗单次免疫后3 周及加强免疫后3 周，诱导鸡产生的平均中和抗体效价分别为4.7 log2 和6.5 log2。血清特异性抗体及中和抗体作为保护性免疫反应的关键因子，能够用于评估疫苗所诱导的免疫应答水平。这些结果表明，该灭活疫苗刺激机体产生了强烈的体液免疫应答，且加强免疫的效果优于单次免疫。

疫苗接种是防控aMPV 传播与流行的重要手段。本研究结果表明aMPV/B 灭活疫苗对商品肉鸡的免疫保护效果良好，加强免疫的保护效果优于单次免疫，这些结果为肉鸡养殖场中的aMPV/B 感染的防控和其灭活疫苗免疫程序的制定提供了参考。