红景天苷对东莨菪碱诱导阿尔茨海默病模型大鼠炎症因子的影响

田诗琪, 赵慧源, 张 帆, 翟春影, 安 昊, 马韬智,梁汶彬, 王金亮, 吴淑琴

(齐齐哈尔医学院, 黑龙江 齐齐哈尔, 161000)

阿尔茨海默症(AD)是一种以认知功能损伤为主的慢性进行性中枢神经系统退行性疾病[1], 其病理学特征以神经炎性斑(NP)、神经原纤维缠结(NFT)、神经元死亡为主。有关AD发病机制的学说有胆碱能学说、自由基学说、β淀粉样蛋白学说、炎症和免疫学说、氧化应激学说等。本研究主要倾向于β淀粉样蛋白学说、炎症和免疫学说。黄振波等[2]指出白细胞介素-1β(IL-1β)可能会损害认知功能，但IL-1β与认知损伤的关系尚不十分清楚。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种炎症介质，在一定条件下可以诱发炎症反应。红景天苷是藏药红景天的一种有效活性成分，在抗氧化损伤、清除自由基、促进细胞代谢、增强细胞活力等方面有独特的功效[3-4]。本研究观察AD大鼠应用红景天苷前后的IL-1β、TNF-α水平变化，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 动物来源

无特定病原体(SPF)级雄性大鼠40只, 2～3月龄，体质量(200.0±10.0) g, 由大连医科大学动物实验中心提供，许可证号为SYXK(黑2016-001)。

1.2 药物与AD模型制备

红景天苷(北京普天同创生物科技有限公司，批号110818-200404)、东莨菪碱氢溴酸盐(上海麦克林生化科技有限公司，批号S817762)、IL-1β ELISA试剂盒(厦门慧嘉生物科技有限公司，批号202010723)、TNF-α ELISA试剂盒(厦门慧嘉生物科技有限公司，批号202010645)。采用腹腔注射东莨菪碱(SCOP) 2 mg/kg的方法, 建立中枢胆碱能系统障碍性AD模型大鼠[5-6]。

1.3 实验分组

将40只大鼠随机分为空白组、模型组以及红景天苷高、中、低剂量组，每组8只。空白组和模型组均给予生理盐水灌胃，剂量为10 mL/(kg·d); 高、中、低剂量组分别给予75、50、25 mg/(kg·d)红景天苷(需将纯度>95%红景天苷粉末与双蒸水混合)。给予红景天苷30 min后，除空白组外，其余4组大鼠均给予SCOP腹腔注射，剂量为2 mg/kg, 连续给药21 d。

1.4 观察指标

1.4.1 行为学检测: 行为学检测在给药21 d后开始进行。Morris水迷宫实验: 圆形水池，直径160 cm, 深50 cm, 站台直径10 cm, 水面高于站台平面约2 cm, 水温控制在(27.0±1.0) ℃, 水池周围以布帘遮挡。实验内容包括适应水迷宫(第1天)、定位航行实验(第2～5天)和空间探索实验(第6天)。实验前1 d将大鼠放置在实验室进行适应，消除恐惧心理。定位航行实验: 每只大鼠每天共进行4次，头面向池壁，分别从水池4个不同象限边缘的中点放入水中; 大鼠找到平台后，让其在平台上停留10 s; 若大鼠在90 s内仍然没有找到水面之下的平台，引导其找到平台，并在平台上停留10 s; 记录大鼠的运动轨迹及找到平台时游过的距离。空间探索实验在第7天进行，撤掉平台，将大鼠由定位航行实验平台所在象限的对侧放入，并记录大鼠90 s内在目标象限(定位航行实验放置平台的象限)所游的距离、在水池中所游的总距离及穿越目标象限次数。以90 s内在目标象限游泳距离占总距离的百分比和穿越目标象限次数作为空间学习与记忆的评价指标[7-9]。

1.4.2 光镜观察细胞形态结构: 水迷宫实验12 h后(禁食不禁水)，分别将5组大鼠采用铡刀断头仪处死，立即开颅取大脑、海马组织、血清样本。大脑及海马组织在-80 ℃冻存，恒冷箱切片，甲醛溶液固定切片。苏木精-伊红染色(HE染色)观察神经细胞形态结构。

1.4.3 IL-1β及TNF-α测定: 取海马组织，匀浆，离心取上清液，采用IL-1β、TNF-α的配套ELISA试剂盒，按照说明书方法检测脑组织内的递质含有量，应用全自动酶标仪检测450 nm吸光度(OD450 nm)值。以吸光度为纵坐标，以标准品剂量为横坐标，绘制标准曲线。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 Morris水迷宫运动轨迹

实验第2天，高剂量组行动轨迹与空白组相似，大鼠对平台位置的记忆能力优于模型组。见图1。

A: 模型组轨迹(密集遍布4个象限,大鼠未记住平台象限位置,仍在摸索寻找平台); B: 空白组轨迹(相对集中在平台相邻的第2象限内,轨迹相对稀疏,可能对平台位置存在潜在记忆); C: 高剂量组轨迹(相对集中在平台相邻的第4象限内,行动轨迹大致与空白组相似,对平台位置的记忆能力优于模型组)。图1 模型组、空白组及高剂量组大鼠Morris水迷宫运动轨迹

2.2 Morris水迷宫实验结果

Morris水迷宫实验结果显示，高剂量组大鼠目标平台象限搜索时间与穿越平台次数比均高于模型组，红景天苷模型组大鼠长于中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05), 表明75 mg/kg红景天苷能改善大鼠的学习记忆功能。见表1、表2、表3。

表1 各组目标平台象限内的搜索时间与穿越平台次数比情况

表2 各组大鼠到达平台的时间 s

表3 各组大鼠的目标象限停留时间 s

2.3 各组大鼠脑TNF-α、IL-1β及海马区域切片比较

与空白组相比，模型组大鼠脑TNF-α、IL-1β水平升高，差异有统计学意义(P<0.05); 与模型组相比，高剂量组和中剂量组大鼠脑TNF-α、IL-1β水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图2。

表4 大鼠海马区炎症因子的变化

A: 空白组,神经细胞排列有序,染色密集,排列整齐紧密; B: 模型组,神经细胞数量明显减少,散在,排列不整齐,组织疏松; C: 低剂量组,少量神经细胞恢复,但排列散在; D: 中剂量组,可见少量变形的神经元,病理改变相较模型组不明显; E: 高剂量组,神经细胞普遍较细,细胞排列整齐、规则、紧密。图2 各组大鼠海马区域切片HE染色结果(放大倍数400倍)

3 讨 论

研究[2]表明IL-1β与认知功能损伤有一定的联系。在AD大鼠模型中, IL-1β、TNF-α水平显著升高，促进白细胞浸润、活化和炎症瀑布反应。本研究观察AD大鼠IL-1β、TNF-α在红景天苷给药前后的变化，发现红景天苷对AD大鼠的学习及认知能力有改善作用，也进一步证明了IL-1β与认知能力的关系。

AD的主要病变部位在大脑，β淀粉样蛋白堆积是其主要病理特征之一[10]。红景天苷具有抗衰老、抗疲劳、保护心脑血管系统、调节免疫系统、防辐射、抗疲劳、抗肿瘤及增强免疫功能等药理作用，其中抗炎作用可调节早期细胞因子引发的炎症反应，通过阻断核转录因子B和细胞外信号调节酶活化作用，从而减少TNF-α、IL-1β的分泌[11], 表明红景天苷可用于治疗炎症反应介导的认知功能障碍，也可缓解海马区的炎症反应。

相比于注射的制备方法, SCOP下的AD模型制备可以直接模拟AD患者的记忆能力减退和学习记忆能力消失，更好地判断炎症因子的改变，避免了颅内手术造成的炎症和神经元损伤，手术创伤不仅激活了外周的免疫反应，也激活了中枢神经系统的免疫反应。研究[12]显示, IL-1β受体缺失大鼠术后神经炎症反应减弱，认知功能受损的发生率明显下降。

Morris水迷宫实验结果表明，腹腔注射SCOP可影响模型组、低剂量组大鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间等指标。在最后1 d的定位巡航实验中，模型组大鼠寻找平台潜伏期增加，穿越平台次数减少，且与红景天苷治疗剂量存在相关性，高剂量组与空白组变化趋势相近，推测长期给予SCOP但不给予红景天苷治疗后，大鼠存在相对的学习记忆损伤。研究[13]发现AD患者脑内有过量的炎症因子TNF-α、IL-1β表达，同时可激活星形胶质细胞和小胶质细胞，并增加其他促炎症因子的释放。β淀粉蛋白沉淀引起的一系列神经毒性作用可导致神经细胞功能紊乱和死亡，并引发痴呆，脑内慢性炎症、氧化应激机制等起着重要的作用[14]。神经元受损是AD病变的一个关键症状[15], 海马区神经元的损伤也是评估患者病情改善情况的重要指标。

综上所述，红景天苷能显著增强AD大鼠的学习记忆能力，减轻海马神经元的损伤，调节中枢炎症状态，修复海马神经元的病理损伤，其机制可能与改善炎症反应、增强免疫功能有关。