血水草TLC鉴别方法的建立

曾 琦 徐作刚

1.黔南州检验检测院，贵州 都匀 558000；2.黔南州检验检测院，贵州 都匀 558000

血水草(EomeconchionanthaHance)是中国亚热带第三纪孑遗物种，是我国独有的单种属植物。血水草主要分布于贵州南部和北部，福建北部和西部，江西、广东、广西、安徽、四川的东部和东南部，浙江西南部，湖南、湖北西南部，云南东部等[1]。《中国植物志》[2]《贵州草药》[3]《黔本草》[4]《中华本草》(苗药卷)[5]等均有收载。血水草 “味苦、性寒、有小毒，具清热解毒、止血、活血止痛之功效，主治目赤肿痛、咽喉疼痛、口腔溃疡、尿路感染、疗疮肿毒、毒蛇咬伤、癣疹、湿疹、跌打损伤、腰痛、咳血”，全草入药[6-7]。至今为止，文献[8-10]报道己从血水草中分离得到6个生物碱和1个三萜类，生物碱类化合物是血水草的主要有效成分,包括白屈菜红碱、血根碱、原阿托品碱、别隐品碱、氧化血根碱、白屈菜红默碱等。根据血水草其化学成分，为有效控制血水草药材质量，选择白屈菜红碱和血根碱为对照对血水草进行TLC鉴别[11]。该方法简便易操作，专属性强，结果重复性较好。

1 仪器与试药

SK250LHC超声波清洗器(上海科导仪器有限公司)，瑞士梅特勒AG135电子天平，血根碱对照品(2～10 ℃冷藏)(批号：510001-201101,含量99.3%，中检院)，白屈菜红碱(111718-201402,含量80.5%，中检院)，样品S1于2020年3月采摘于都匀市摆忙乡，S2 于2020年6月采摘于重庆市奉节县，S3于2020年9月采摘于贵定县岩下村，硅胶G(批号：20160926),硅胶G (批号：00081110)，均为青岛海洋化工有限公司制造；其余试剂均为分析纯。样品采集信息见表1，均经贵州中医药大学魏升华教授鉴定。样品洗净后晒干，粉碎，过2号筛，放入干燥器中常温保存。如图1所示。

A.2020年4月采摘于都匀市摆忙乡；B.2020年4月采摘于福建南平市；C.2020年9月拍摄于贵定县岩下村；D.2020年8月拍摄于广西桂林全州方县大西镇炎井村图1 血水草干品及深景图

表1 血水草样品采集信息

2 试验方法与试验结果

2.1 样品中所需成分提取方法的考察 分别取样品S1～S3各1.0 g，按下述方法提取：①加甲醇 20 mL，53 HZ超声30 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液；②加75%乙醇20 mL，53 HZ超声 30 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液；③加二甲基亚砜20 mL，53 HZ超声30 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

另取血根碱对照品及白屈菜红碱对照品适量，加乙醇分别制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。取上述供试品溶液及对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G板上，以甲苯-甲醇-氨水(24∶1∶0.05)的混悬溶液为展开剂，饱和30 min后，展开，取出，晾干，在紫外灯(365 nm)下检视。

试验结果：方法①主斑点清晰；方法②主斑点清晰，且提取溶剂毒性较小；方法③主斑点未能显示，未能辨别。方法②操作简便，溶剂毒性较小，薄层色谱图谱展距适中，斑点清晰，干扰少，故选择方法②为供试品溶液的制备方法。

2.2 不同展开系统的考察 取S1～3样品按提取方法②制成供试品溶液，取供试品溶液和对照品溶液各2 μL，点于硅胶G薄层板上，分别在下述展开系统中展开：①氯仿-甲醇(12∶4)；②氯仿-甲醇-乙酸乙酯(14∶1∶1)；③氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(9∶1∶0.2∶0.05)；④甲苯-甲醇-氨水(24∶1∶0.05)。分别均饱和30 min后，在各展开系统中展开，取出，晾干，在紫外灯(365 nm)下检视。试验结果如附图2所示。

1.血根碱对照；2.白屈菜红碱对照；3.样品S1；4.样品S2；5.样品S3; A. 氯仿-甲醇(12∶4)展开剂；B.氯仿-甲醇-乙酸乙酯(14∶1∶1)；C.氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(9∶1∶0.2∶0.05)；D.甲苯-甲醇-氨水(24∶1∶0.05)图2 血水草TLC图

试验结果：系统①②样品与对照品完全未分离，系统分离效果非常差，斑点不清晰，拖尾较严重；系统③两个主斑点清晰，分离效果好，但展开剂中氯仿毒性较大；系统④两个主斑点清晰，分离效果好，展开剂的毒性较小，因此选择④为血水草薄层色谱鉴别的展开系统。

2.3 耐用性考察 按照国家药典委员会《中药分析方法验证指导原则实施细则》的相关要求，分别进行耐用性考察。

样品点样量的考察：取S5样品按提取方法②制成供试品溶液，分别取供试品溶液1、2、3、5、6、8、10 μL，点于同一硅胶G板上，以甲苯：甲醇：氨水(24∶1∶0.05)溶液为展开剂，饱和30 min后，展开，取出，晾干，在365 nm紫外灯下观察，结果供试品溶液以点样量2 μL效果最佳。考虑因产地、季节影响，样品含量有所差异，故点样体积选择为2 μL。

温度的考察：进行了低温(10 ℃)、室温(25 ℃)、高温(35 ℃)的考察，分离效果均较好，斑点清晰，三个温度下的展开效果均未有明显差异。

湿度的考察：进行了低湿度(30%)、中等湿度(50%)和高湿度(75%)的考察，结果表明在上述条件下都能较好分离，未有明显差异；耐用性较好。

薄层板的考察：选用硅胶G预制板、自制硅胶G板，结果均能较好分离。

2.4 血水草的薄层色谱鉴别方法 取本品细粉1.0 g，加75%乙醇20 mL，超声30 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取血根碱，白屈菜红碱对照品适量，加乙醇分别制成每1 mL含0.5 mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》 2015版通则0502)试验，吸取上述三种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-甲醇-氨水(24∶1∶0.05)的混悬溶液为展开剂，硅胶G薄层板置层析缸中饱和30 min，展开，取出，晾干，在紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。10批次样品薄层色谱图如图3所示。

图3 10批血水草药品TLC图

3 讨论

生物碱是血水草中的主要成分及药理活性物质，当中以白屈菜红碱和血根碱的含量较高，且易溶于甲醇，乙醇，二甲基亚砜等有机溶剂。故选取安全、经济且最常用的75%乙醇作为提取溶剂，且血水草中其他组分对检测干扰较小。文中所用到的③④展开剂，都能达到预期效果，但由于展开剂③中氯仿的毒性较大，故选用毒性较小的展开剂④；血水草全草中所显主要斑点与血根碱对照、白屈菜红碱对照色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，位置居中，温湿度或薄层板厚度对色谱效应的影响较小结果稳定，重复性较好。参照薄层色谱法(2015年版《中国药典》通则0502)，分别对展开剂，薄层板等条件进行考察，并按照国家药典委员会《中药分析方法验证指导原则实施细则》的相关要求进行方法学耐用性考察。

本方法筛选出的薄层色谱鉴别方法分离度较好，专属性强，可作为血水草中血根碱和白屈菜红碱的薄层鉴别方法。