干扰TOX基因联合抗CD38 CAR-T细胞的构建及其对血液肿瘤细胞增殖和凋亡能力的影响

宋志茹，刘秀盈，朱晶晶，刘静静，冯娅茹，王建勋，2

1北京中医药大学生命科学学院，北京102488；2深圳北京中医药大学研究院

血液系统恶性肿瘤主要包括淋巴瘤、白血病以及多发性骨髓瘤等，其中多发性骨髓瘤是一种克隆性浆细胞为特征的恶性肿瘤[1]，目前其主要治疗药物是免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂、单抗类药物以和糖皮质激素[2]。以硼替佐米为代表的蛋白酶体抑制剂及来那度胺为代表的免疫调节剂治疗已经取得较好的效果，但仍无法减少不良反应及抑制肿瘤复发[3]。免疫治疗是近年肿瘤治疗领域的研究热点，嵌合型抗原受体基因修饰的T细胞(CAR-T细胞)属于细胞免疫治疗[4]，是将特异性抗体与相对应的抗原结合和T淋巴细胞对靶细胞的细胞毒活性同时发挥作用的一种方法[5]。将这种经体外基因修饰后的T细胞回输患者体内，能够识别特定肿瘤细胞，且不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制[6-7]。CD38抗原是一种跨膜糖蛋白，是浆细胞表面重要的标志物[8]。CD38广泛表达在多发性骨髓瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、复发性急性淋巴细胞白血病等各种类型的血液瘤细胞上，是CAR-T细胞免疫疗法的一个合适的靶点[9]。但长期肿瘤抗原及其他免疫抑制信号刺激使得CD38 CAR-T细胞功能逐渐衰减，发生T淋巴细胞耗竭，不能有效杀伤肿瘤细胞[10]。胸腺细胞选择相关高迁移率群体盒(TOX)蛋白是一个重要的DNA结合因子[11]，通过修饰局部染色质结构以及调节多蛋白复合物的生成进而调控转录，在T淋巴细胞发育和分化中具有重要调节作用[12]。研究表明，TOX高表达加速了血液肿瘤患者中T淋巴细胞的耗竭；反之，当TOX表达下降时，T淋巴细胞耗竭的情况可显著改善。2020年1月—2021年10月，本研究采用shRNA技术敲低TOX在重组CD38 CAR-T细胞中的表达，观察其在体外抑制血液肿瘤细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人多发性骨髓瘤荧光素酶标记细胞RPMI-Luc和逆病毒包装细胞系PG13购自美国ATCC细胞库，人Burkitt′s淋巴瘤荧光素酶标记细胞Raji-Luc购自北京维通达生物技术有限公司。AIM-Ⅴ完全培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)及PBS缓冲液购自美国Gibco公司，淋巴细胞分离液购自北京友谊中联生物科技有限公司，转染试剂Fu Gene HD购自美国Promega公司，白细胞介素2(IL-2)、CD3单克隆抗体OKT-3购自北京义翘神州科技股份有限公司，DH-5α感受态、MluⅠ酶、T4连接酶、NotⅠ酶、荧光素酶报告基因检测试剂盒、质粒提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒购自北京兰博利德科技有限公司，RNA提取试剂盒购自上海优宁维公司，干扰素γ(IFN-γ)ELISA试剂盒购自北京百诺威生物公司，CD38-APC、MYC-PE、CD3-APC、PD-1-PE、CD69-PE抗体购自美国BD公司。二氧化碳培养箱(Thermo，Heracell 240i)，高速离心机(Thermo，75006590)，实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher，QuantStudio TM6 Flex)。

1.2 原代T淋巴细胞的提取 采集3例健康志愿者(男2例、女1例,知情同意)外周血，加入淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，重悬于含10% FBS、1%青—链霉素溶液的AIM-Ⅴ完全培养基。加入终浓度为100 ng/mL的OKT-3和100 U/mL的IL-2刺激T淋巴细胞活化增殖。每隔48 h用含100 U/mL IL-2的AIM-Ⅴ完全培养基传代培养。

1.3 TOX基因shRNA联合抗CD38 CAR分子的构建 亲和力较强的CD38 CAR由本实验室前期通过噬菌体展示技术筛选获得，采用二代CAR结构。首先将抗原识别片段CD38 ScFv、CD8铰链区和跨膜区、胞内区CD28与胞内区CD3ζ串联，并在ScFv区前加入MYC标签，便于后续检测。然后通过GPP Web Portal网址设计靶向TOX的shRNA序列，另设计一条不针对任何靶点的无意义RNA序列作为对照。在这些设计好的RNA序列之前串联U6启动子序列，完成shRNA靶向抑制TOX的CD38 CAR分子的构建。对照组插入添加无意义RNA序列的抗CD38 CAR，命名为CD38 CAR；实验组CAR命名为TOX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR。以上CAR分子构建完成后，酶切并连接逆病毒载体包装质粒pMFG，命名为pMFG-MYC-CD38 CAR、pMFG-TOX-shRNA1-MYC-CD38 CAR和pMFG-TOX-shRNA2-MYC-CD38 CAR。

1.4 CAR-T细胞的制备与分组 将pMFG-MYC-CD38-CAR、pMFG-TOX-shRNA1-MYC-CD38-CAR和pMFG-TOX-shRNA2-MYC-CD38-CAR质粒载体进行逆转录病毒载体包装。经逆病毒载体滴度检测，CD38 CAR、TOX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR转导PG13细胞的转导效率分别为77.4%、78.6%和83.7%，逆病毒载体滴度均>1 107 copies/mL，表明逆病毒载体滴度达到转导要求，可进行后续T淋巴细胞转导实验。提取分离原代T淋巴细胞后培养48 h，将其分为CD38 CAR-T组、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组，分别转导CD38 CAR、TOX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR，获得CD38 CAR-T细胞、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T细胞和TOX-shRNA2-CD38 CAR-T细胞。转导48 h后，用流式细胞术通过MYC-PE抗体染色检测抗原表达，计算转导效率。转导效率=MYC-PE阳性细胞数/总活细胞数×100%。以转导效率达到40%以上为成功标准。

1.5 CAR-T细胞TOX mRNA相对表达量检测 采用RT-QPCR法。转导48 h后，三组各取5×106个活细胞，提取RNA，凝胶电泳验证其完整性，然后反转录为cDNA，采用SYBR green进行RT-QPCR反应。以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCT法计算TOX mRNA相对表达量。

1.6 CAR-T细胞增殖能力观察 转导48 h后，加入染色剂，使用细胞计数仪读取三组细胞密度，之后每48 h计数并继续传代培养，维持细胞密度为5×105/mL，计算单次生长倍数(即本次计数时细胞密度与上次计数时的细胞终密度的比值)。单次生长倍数的乘积即生长倍数，其中第0天(提取PBMC当天)单次生长倍数、生长倍数均定为1。记录0～10 d体外培养生长倍数的对数值，绘制增殖曲线。

1.7 CAR-T细胞与血液肿瘤细胞共培养后活化情况观察 采用流式细胞术。取Raji-Luc、RPMI-Luc细胞，加入CD38-APC避光染色60 min，PBS冲洗，重悬在PBS中，上流式细胞仪检测，结果显示Raji-Luc、RPMI-Luc细胞表面CD38表达效率分别为95.21%±0.80%和96.34%±3.76%，表明本实验采用的血液肿瘤细胞表面高表达CD38，可作为抗CD38 CAR-T细胞的靶细胞。取三组CAR-T细胞，分别与等量血液肿瘤细胞共培养48 h，400 g离心5 min，收集细胞。PBS冲洗，加入CD3-APC、CD69-PE避光染色60 min，PBS缓冲液冲洗1遍，重悬在PBS中，上流式细胞仪检测，读取CAR-T细胞与血液肿瘤细胞共培养后细胞表面CD69的表达效率，以此反映CAR-T细胞活化情况。

1.8 血液肿瘤细胞刺激下CAR-T细胞体外增殖能力观察 采用CFSE染色法。取Raji-Luc、RPMI-Luc细胞，加入含IL-2的AIM-Ⅴ完全培养基，稀释至细胞密度4×104/100 μL，按100 μL/孔接种于96孔培养板。取三组CAR-T细胞，加入CFSE荧光染料，37 ℃避光孵育30 min。将细胞按1×104/孔加入预设孔中，最终效靶比设为1∶4。培养24 h后，用CD3-APC抗体染色标记T淋巴细胞以区分效应细胞和靶细胞。通过流式细胞术对比CFSE荧光信号强弱来衡量细胞增殖情况，CFSE标记的是CAR-T细胞，当CAR-T细胞增殖时CFSE信号会递减，故CFSE信号越弱表示细胞增殖能力越强。

1.9 CAR-T细胞对血液肿瘤细胞杀伤能力观察 采用荧光素酶化学发光法。分别制备Raji-Luc、RPMI-Luc细胞悬液，参照1.8中铺板方法进行实验铺板。将CAR-T细胞与Raji-Luc、RPMI-Luc靶细胞分别以1∶2、1∶4、1∶8的效靶比与CD38 CAR-T组、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组细胞共培养，只加入Raji-Luc细胞或RPMI-Luc细胞的孔标记为最大释放孔，加入培养基的孔作为空白孔。共培养6 h后，每孔加入100 μL荧光素酶底物，室温避光培养5 min。设置化学发光模式，全白酶标板，震板时间5 s，同步超快光子计数的低噪音光电倍增管(PMT)设为500。杀伤效率的计算公式为：杀伤效率=1-(实验孔细胞凋亡率-空白孔细胞凋亡率)/(最大释放孔细胞凋亡率-空白孔细胞凋亡率)×100%。

1.10 血液肿瘤细胞刺激下CAR-T细胞IFN-γ释放水平检测 采用ELISA法将三组CAR-T细胞与Raji-Luc、RPMI-Luc细胞分别共培养6 h(效靶比为1∶2)，400 g离心5 min，取上清，使用ELISA试剂盒检测IFN-γ水平。

1.11 CAR-T细胞耗竭情况观察 采用流式细胞术。取CAR-T细胞悬液，400 g离心5 min，弃上清，收集细胞。PBS冲洗，同时加入CD3-APC、PD-1-PE抗体避光孵育60 min。PBS洗涤，弃上清并重悬于PBS，上流式细胞仪检测CAR-T细胞表面PD-1的表达，通过PD-1表达量衡量CAR-T细胞耗竭情况。

2 结果

2.1 三组CAR-T细胞转导效率检测结果 CD38 CAR-T组、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组的转导效率分别为41.51%、41.28%、44.84%，均超过40%，表明CAR分子在T淋巴细胞表面成功表达。

2.2 三组CAR-T细胞TOX mRNA表达水平比较 CD38 CAR-T组、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组TOX mRNA的相对表达量分别为1、0.84±0.14、0.68±0.70。TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组TOX mRNA表达水平低于CD38 CAR-T组(P<0.05)，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组TOX mRNA表达水平与CD38 CAR-T组比较差异无统计学意义(P>0.05)。TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组的TOX mRNA的相对表达量降低30%以上，表明其RNA干扰效果较好。

2.3 三组细胞增殖能力比较 CAR-T细胞在体外培养0～10 d的生长倍数对数值见表1，三组CAR-T细胞在体外均能稳定增殖，三组CAR-T细胞生长倍数对数值比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 CAR-T细胞的体外增殖的生长倍数对数值

2.4 CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后细胞表面CD69表达效率比较 与等量肿瘤细胞共培养后，三组细胞表面CD69表达效率均升高(P<0.01)，见表1。

表1 三组细胞在与肿瘤细胞共培养后表面CD69表达效率比较

2.5 CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后增殖情况比较 与CAR-T单独培养时相比，三组CAR-T细胞与Raji-Luc、RPMI-Luc细胞共培养后FITC信号左移，表明CAR-T细胞在肿瘤细胞的刺激下增殖加快，CAR-T细胞被肿瘤细胞激活。见图2。

注：a为CAR-T与Raji-Luc共培养；b为CAR-T与RPMI-Luc共培养；c为CAR-T单独培养。

2.6 三组细胞在不同效靶比时对肿瘤细胞的杀伤效率比较 三组细胞分别与Raji-Luc、RPMI-Luc细胞共培养后，在不同效靶比时，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组的杀伤效率均高于CD38 CAR-T组(P<0.05或<0.01)，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组与CD38 CAR-T组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2、表3。

2.7 三组细胞在血液肿瘤细胞刺激下IFN-γ释放水平检测 TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组IFN-γ释放水平较CD38 CAR-T组升高(P<0.05)，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组与CD38 CAR-T组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表2 三组细胞在不同效靶比时对Raji-Luc细胞的杀伤效率比较

表3 三组细胞在不同效靶比时对RPMI-Luc细胞的杀伤效率比较

表4 三组细胞在Raji-Luc、RPMI-Luc细胞刺激下IFN-γ释放水平比较

2.8 三组CAR-T细胞耗竭情况比较 CD38 CAR-T组、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组PD-1表达效率分别为32.55%±4.88%、26.45%±5.45%、16.50%±2.97%。与CD38 CAR-T组相比，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组PD-1表达无明显变化(P>0.05)，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组PD-1表达下降(P<0.05)。

3 讨论

在过去的几十年里，血液肿瘤常规治疗以药物治疗为主，严重者需手术、放化疗。但这些治疗方法仅能抑制肿瘤细胞的生长，无法彻底杀死肿瘤细胞，因此多数血液肿瘤患者最终进展至复发难治阶段甚至死亡。CAR-T细胞疗法的原理是通过基因工程技术将抗原分子的抗体可变区基因序列与淋巴细胞免疫受体的胞内区序列融合成嵌合分子，再利用病毒载体介导嵌合分子转导T淋巴细胞，细胞表面即可表达融合蛋白，经CAR分子修饰后的T淋巴细胞具备靶向抗肿瘤活性，且不受到MHC的限制。靶向肿瘤限制性抗原是CAR-T治疗成功的关键，由于CD38可以在恶性B细胞瘤上长时间地表达，使其成为CAR-T细胞治疗的一个研究靶点[13]。细胞毒性T淋巴细胞是对病毒感染和恶性肿瘤保护性免疫的重要介质。然而，长期暴露在同种抗原下往往会削弱T淋巴细胞的效应能力，限制其治疗潜力，我们称之为T淋巴细胞耗竭。CAR-T细胞回输到体内后，必须扩增到一定数量并存活足够长的时间才能有效杀伤肿瘤细胞，CAR-T细胞功能衰竭会降低CAR-T细胞对肿瘤的治疗效果。临床试验表明，TOX与耗竭的T淋巴细胞高度相关，TOX通过上调肿瘤中的IC蛋白促进肿瘤内T淋巴细胞耗竭，其可能是促进患者T淋巴细胞耗竭的关键调节因子[14]。因此调节耗竭T细胞TOX表达可能为提高血液肿瘤免疫治疗效果提供新的策略[15]。

本研究通过RNA干扰技术，在实验室前期构建的CD38 CAR-T细胞的基础上，设计TOX基因shRNA联合抗CD38 CAR分子，包装为逆转录病毒载体并成功转导人原代T淋巴细胞，成功构建TOX-shRNA-CD38 CAR-T细胞。实验发现，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组与CD38 CAR-T组相比TOX mRNA表达水平下降，这表明shRNA2序列靶向性更强；三组细胞培养0～10 d的生长倍数对数值比较差异均无统计学意义，说明三组细胞体外均能稳定增殖；本研究采用Raji-Luc和RPMI-Luc两种高表达CD38的细胞系作为靶细胞，在相同的体外培养条件下，三组细胞在分别与两种靶细胞共培养时比三组细胞单独培养时其表面CD69的表达均更高，细胞表面糖蛋白CD69是T细胞活化的另一个标记，因此我们得知在对应靶抗原刺激下，三组 CAR-T细胞均被激活；从CFSE结果来看，三组CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后FITC信号均左移，表明CAR-T细胞在肿瘤细胞的刺激下增殖加快。随后我们用这三组细胞以效靶比1∶2、1∶4、1∶8分别作用于Raji-Luc和RPMI-Luc细胞，观察其杀伤效率，结果显示TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组杀伤效率强于CD38 CAR-T组。T细胞耗竭或功能障碍表现为减少细胞因子和效应分子的表达，上调抑制性受体PD-1的表达[16]，而T细胞与肿瘤细胞发生反应会释放细胞因子IFN-γ，检测IFN-γ也可从侧面反映T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。三组细胞杀伤Raji-Luc、RPMI-Luc细胞后，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组IFN-γ释放水平较CD38 CAR-T组升高，且TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组与不同靶细胞共培养时IFN-γ释放量均高于2 000 pg/mL，这说明TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组细胞被靶抗原激活后产生大量IFN-γ细胞因子。同时我们发现，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组与CD38 CAR-T组相比PD-1表达水平降低，即TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组细胞耗竭因子水平更低。这提示抑制CAR-T细胞TOX表达可以提高其增殖能力和杀伤肿瘤的能力，起到减缓T细胞耗竭的作用。

综上所述，本研究成功构建了抑制TOX基因联合抗CD38 CAR-T细胞，即TOX-shRNA-CD38 CAR-T细胞，其能有效抑制TOX表达，经靶抗原激活后增殖能力及抗肿瘤能力显著增强，且TOX-shRNA-CD38 CAR-T细胞的耗竭也得到改善。T淋巴细胞的效应能力是影响CAR-T细胞治疗效果的关键问题之一，基于构建的TOX shRNA系统联合CD38 CAR-T的良好效果不需要与小分子免疫检查点抑制剂同时使用，也可达到增强CAR-T细胞活性，在一定程度上提高治疗效果，免去了对于小分子药物与重组CAR-T细胞联用时剂量的摸索，使得增强CAR-T细胞抗肿瘤能力以及减缓衰竭的方法更加高效便捷，未来TOX基因shRNA联合CAR-T的实验方案在血液肿瘤和实体肿瘤的治疗方面具有良好的应用前景。