薄芝糖肽联合顺铂对食管鳞状细胞癌细胞增殖凋亡及相关信号通路的影响
2022-01-27薛晓婕李飞容孙秋萍
薛晓婕,李飞容,孙秋萍
1鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)检验科,湖北黄石435000;2肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室;3武汉科技大学医学院;4鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)
食管癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,具有发病率高、侵袭性强、病死率高等特点[1]。目前食管癌的治疗方式包括手术、放疗和化疗,而传统抗肿瘤药物如顺铂等因选择性差易引起较严重的不良反应,如何减少化疗药物不良反应是目前亟待解决的难题[2-3]。薄芝糖肽(GCGP)是从灵芝属薄树芝的干燥菌丝体粉末中提取而成,具有护肝、抗炎、免疫调节及辅助抗肿瘤等多种作用。研究显示,其对机体非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫等均有促进作用,同时具有抗氧化、清除氧自由基的作用,且成分稳定,不良反应少[4]。鳞状细胞癌是食管癌的主要组织学类型,目前关于GCGP联合顺铂对食管鳞状细胞癌的抑制作用及其机制的相关研究较少。促分裂原活化的蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路是将胞外信号传递到细胞核内最重要的信号通路,在调控细胞增殖分化、血管生成和代谢等功能中起关键作用。2019年10月—2021年4月,我们通过体外培养食管鳞状细胞癌Eca-109细胞,观察GCGP联合顺铂对其增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制与MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路的关系,旨在为临床治疗食管癌提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞、试剂与仪器 Eca-109细胞株购于中科院上海细胞所。GCGP注射液(北京赛升药业股份有限公司),顺铂(美国Sigma-Aldrich公司),胎牛血清、RPMI1640完全培养基(美国Gibco公司),青霉素—链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶(北京索来宝科技有限公司),四氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司),MAPK/ERK信号通路调控蛋白胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP-4)、妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)、ERK及PI3K/Akt信号通路调控蛋白尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、Akt一抗(美国Sigma公司),β-actin二抗、细胞裂解液、PVDF膜(上海碧云天生物技术有限公司),BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo),FITC和PI(美国Sigma公司),GAPDH(美国Santa Cruz公司)。CO2饱和湿度细胞培养箱(美国赛默飞公司);酶标仪(美国赛默飞公司),倒置显微镜(日本Olympus公司),流式细胞仪(美国Beckman公司),SDS-PAGE电泳仪(美国Bio-rad公司)。
1.2 细胞培养 取Eca-109细胞,加入0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞,加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素—链霉素混合液的RPMI1640完全培养基中,置于5% CO2饱和湿度细胞培养箱中培养,每2~3 d传代1次。
1.3 GCGP与顺铂最佳作用浓度及最佳作用时间的筛选 采用MTT法。取对数生长期细胞,加入胰酶进行消化,用DMEM培养液配置成单细胞悬液,按3×104/孔接种于96孔培养板,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h。弃培养液,分别加入50、100、200 mg/L GCGP溶液2 mL,再加入100 ng/mL顺铂2 mL,置于培养箱中继续培养。培养24、48、72 h后,每孔分别加入5 mg/mL MTT 10 μL,继续培养4 h,吸去上清液,加入150 μL DMSO溶液,振荡培养10 min。上酶标仪,于波长490 nm处检测光密度(OD)值,计算细胞存活率。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%。根据细胞存活率绘制细胞增殖抑制曲线。结果显示,GCGP和顺铂对Eca-109细胞均具有毒性作用,100 mg/L GCGP作用48 h时的IC50为54.9%;以100 mg/L GCGP联合100 ng/mL顺铂作用48 h时的IC50为44.1%。因此选择100 mg/L GCGP联合100 ng/mL顺铂作用48 h作为最佳作用浓度和最佳作用时间。
1.4 细胞增殖能力观察 采用细胞克隆形成实验。取对数生长期细胞,按3×105/孔接种于6孔培养板。待细胞贴壁后,将细胞分为对照组、GCGP组、顺铂组和GCGP+顺铂组,对照组正常培养,GCGP组加入100 mg/L GCGP,顺铂组加入100 ng/mL顺铂,GCGP+顺铂组加入100 mg/L GCGP和100 ng/mL顺铂,各组继续培养48 h。去除含药培养基,加入2 mL新鲜培养基继续培养,直到形成肉眼可见的细胞集落方可终止培养。PBS清洗细胞,加入多聚甲醛固定20 min,PBS清洗。显微镜下拍照,用Image J软件分析细胞克隆数目。细胞集落形成率(%)=(实验组细胞集落形成数/对照组细胞集落形成数)×100%。
1.5 细胞凋亡率检测 取对数生长期细胞,加入0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液,按3×105/孔接种于6孔培养板。将细胞分为对照组、GCGP组、顺铂组和GCGP+顺铂组,对照组正常培养,GCGP组加入100 mg/L GCGP,顺铂组加入100 ng/mL顺铂,GCGP+顺铂组加入100 mg/L GCGP和100 ng/mL顺铂,继续培养48 h。上流式细胞仪,用488 nm激光激发和530 nm发射滤光片检测细胞凋亡率,采用Flow J软件进行分析。
1.6 细胞PAPP-A、IGFBP-4、uPA、ERK、Akt蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集培养48 h的四组细胞,1 500 r/min离心5 min,加入细胞裂解液吹打均匀,4 ℃振摇30 min。收集细胞裂解液于EP管中,4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,取上清液,用BCA法行蛋白定量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白转至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,分别与鼠抗人PAPP-A、IGFBP-4、uPA、ERK和Akt单克隆抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜,HRP标记荧光抗鼠二抗1∶5 000室温避光孵育2 h,洗涤3次,每次10 min,将PVDF膜置于化学反应液中5 min进行显色,取出洗净膜,将其放置荧光化学发光图像分析仪中进行曝光,采用Image J 图像软件对结果进行分析。以目的蛋白与内参β-actin蛋白的比值表示目的蛋白的相对表达量。
2 结果
2.1 四组细胞增殖能力比较 对照组、GCGP组、顺铂组和GCGP+顺铂组的细胞集落形成率分别为100%、57.2%±4.2%、43.8%±5.1%、11.9%±3.6%。与对照组比较,GCGP组、顺铂组和GCGP+顺铂组细胞集落形成率均降低,且GCGP+顺铂组细胞集落形成率低于GCGP组和顺铂组(P均<0.01)。
2.2 四组细胞凋亡率比较 对照组、GCGP组、顺铂组和GCGP+顺铂组的细胞凋亡率分别为1.3%±0.8%、22.5%±3.8%、38.7%±4.2%、61.6%±5.9%。与对照组比较,GCGP组、顺铂组、GCGP+顺铂组细胞凋亡率均升高,且GCGP+顺铂组细胞凋亡率高于GCGP组和顺铂组(P<0.05或<0.01)。
2.3 四组细胞PAPP-A、uPA、IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表达水平比较 与对照组比较,GCGP组、顺铂组和GCGP+顺铂组中PAPP-A、uPA蛋白表达均降低,IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表达均升高(P<0.05或<0.01),与GCGP组和顺铂组比较,GCGP+顺铂组PAPP-A、uPA蛋白表达降低,IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表达升高(P均<0.05)。见表1。
表1 四组细胞PAPP-A、uPA、IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表达水平比较
3 讨论
食管癌的传统治疗方法包括化学治疗、放射治疗、外科治疗、综合治疗等,但均无法降低食管癌术后高复发率及高病死率。新的药物联合化疗药物在恶性肿瘤的治疗中具有广阔的应用前景,联合用药目前已在急性白血病和胰腺导管腺癌等癌症的治疗中取得一定的疗效,其可针对不同致癌细胞信号通路减少单独用药的不良反应和并发症[5],但其在食管癌中的应用研究尚少。顺铂是传统的化疗药物,已有研究指出,长期使用该药物具有一定的耐药性[6-7]。GCGP由多肽和多糖组成,具有多种免疫调节功能以及抗氧化、清除氧自由基的作用。研究表明,GCGP具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、调节心血管系统活性、护肝解毒、镇静、降血糖等作用[8-10],作为一种高效抗肿瘤药物已经引起人们的广泛关注。
肿瘤的发生发展与肿瘤细胞的过度增殖和凋亡减少密切相关。正常人体组织、细胞的生长受到精确调控,而肿瘤细胞具有无限生长的特性,肿瘤细胞的无限生长是肿瘤细胞凋亡受抑制的结果,细胞凋亡障碍与肿瘤的发生发展具有密切关系[11-13]。本研究结果显示,与对照组比较,GCGP组、顺铂组和GCGP+顺铂组食管鳞状细胞癌Eca-109细胞集落形成率均降低,细胞凋亡率均升高,且GCGP+顺铂组细胞集落形成率低于GCGP组和顺铂组、细胞凋亡率高于GCGP组和顺铂组。说明GCGP、顺铂单独或联合应用均可抑制Eca-109细胞增殖并促进其凋亡,而与单独用药相比较,联合用药能更加有效地抑制Eca-109细胞增殖、促进细胞凋亡。
MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路是两条经典的促进生长和抗凋亡的信号转导通路,当被异常活化后可促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、血管形成、抑制凋亡、参与自噬等。PAPP-A被认为与促进肿瘤有关,PAPP-A表达与IGFBP-4密切相关,PAPP-A升高可降低IGFBP-4表达,促进肿瘤发生发展[11-12]。IGFBP-4被PAPP-A降解后,IGFBP-4裂解释放出IGF-1,活化MAPK/ERK信号通路,下游MAPK和ERK被进一步激活[13-15]。uPA是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶,可将纤溶酶原激活成纤溶酶,纤溶酶可降解纤维蛋白、层黏连蛋白,促进肿瘤侵袭和转移[16]。PI3K普遍存在于静息细胞的细胞质中,属于原癌基因的一种,uPA活化可激活PI3K/Akt信号通路,PI3K活化后,下游Akt被进一步激活,该研究结果在乳腺癌细胞中得到证实[17-18]。本研究结果显示,与正常组相比,GCGP+顺铂组IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表达明显升高,PAPP-A、uPA蛋白表达明显下降。这表明下调PAPP-A和uPA蛋白表达,可以激活MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路上的IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表达,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡,发挥抗肿瘤作用。
综上所述,GCGP联合顺铂能够抑制食管癌Eca-109细胞增殖,并诱导其发生凋亡,其机制可能与其激活MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路的相关蛋白IGFBP-4、ERK、Akt表达,下调PAPP-A、uPA蛋白表达有关。