补骨脂总黄酮提取工艺的优化

鲁宪坤， 翟鑫源， 李方红， 王 萧， 张富坤， 张珊珊， 赵 盼， 赵东升*

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355)

随着机体的衰老，一些内源性抗氧化酶的活力逐渐降低，使得小分子活性氧自由基在体内蓄积过多，细胞膜中的不饱和脂肪酸被过多的活性氧自由基损害，引起脂质过氧化反应[1-2]，这类反应会对细胞器的结构和功能产生损害，并且引起细胞受损甚至死亡，导致心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等疾病[3-6]。为了降低脂质过氧化对机体造成的损伤，研发抗氧化剂已成为热点，而中药作为优良的天然抗氧化剂，正获得了人们青睐。

补骨脂为豆科补骨脂属植物补骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果实，已广泛应用于医疗、食品、化妆品等多个领域，具有多种生物作用，如抗氧化、抗菌、雌激素样、抗抑郁、抗肿瘤、抗骨质疏松等[7-9]，主要含有黄酮、苯并呋喃、单萜酚、香豆素、拟雌内酯等活性成分[7-8,10]，现已从中分离出黄酮、二氢黄酮、异黄酮、查尔酮等五十余种黄酮[7-8]。目前，对补骨脂黄酮的研究大多为补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚等单一成分，或醇提黄酮的药理活性或构-效关系[9,11-13]，鲜有涉及总黄酮提取工艺。

中药所含成分复杂，仅凭借个别化合物含量高低来评价其提取工艺的优劣具有一定局限性，若能采用提取率与生物活性相整合的方法，则可更综合全面地进行评价[14-16]。因此，本实验在整合“成分-抗氧化活性”的模式下，以提取率、体外抗氧化活性为指标，采用双响应面法优化补骨脂总黄酮提取工艺，以期为该成分的深入研发利用提供理论依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 芦丁对照品(纯度大于98%，上海源叶生物科技有限公司)。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，纯度≥97%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。补骨脂(产地四川)购自安徽亳州中药材批发市场，经山东中医药大学孙稚颖教授鉴定为豆科补骨脂属植物补骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果实。亚硝酸钠(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；硝酸铝(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；氢氧化钠(分析纯，天津市汇杭化工科技有限公司)；无水乙醇(分析纯，天津富宇精细化工有限公司)。

1.2 仪器 X-5紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；ST 16R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；KQ-500GVDV双频恒温数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 精密称取0.5 g药材粉末，置于50 mL离心管中，超声提取后13 000 r/min离心25 min，取上清液，即得。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 方法学考察

2.2.1.1 线性关系考察 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[17]，分别精密吸取0.2 mg/mL芦丁对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于10 mL量瓶中，加水至2.5 mL，加入0.4 mL 5%NaNO2溶液，摇匀，反应6 min；0.4 mL 10%Al(NO3)3溶液，摇匀，反应6 min；6.0 mL 4%NaOH溶液，无水乙醇定容至刻度，摇匀，室温静置15 min，在510 nm波长处测定吸光度，平行3次，取平均值，以吸光度为纵坐标(A)，芦丁质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为A=11.936X-0.003 4(r=0.999 2)，在0～0.05 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.1.2 精密度试验 精密吸取0.2 mg/mL芦丁对照品溶液0.5 mL，按“2.2.1.1”项下方法测定吸光度6次，测得其RSD为1.23%，表明仪器精密度良好。

2.2.1.3 稳定性试验 取“2.1”项下供试品溶液0.2 mL，于0、2、4、8、24、48 h按“2.2.1.1”项下方法测定吸光度，测得其RSD为1.53%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

2.2.1.4 重复性试验 精密称取0.5 g药材粉末，平行6份，按“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1.1”项下方法测定吸光度，测得其RSD为0.74%，表明该方法重复性良好。

2.2.1.5 加样回收率试验 精密称取总黄酮含量已知的药材粉末0.5 g，平行12份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，其中3份为空白，其他9份每3份分别加入高、中、低质量浓度芦丁对照品溶液，按“2.2.1.1”项下方法测定吸光度，计算回收率。结果，芦丁平均加样回收率为101.35%，RSD为1.13%。

2.3 单因素试验 精密称取0.5 g药材粉末，分别设定乙醇体积分数为60%、70%、80%、90%、100%，液料比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，提取温度为30、40、50、60、70 ℃，提取时间为20、30、40、50、60 min，提取功率为250、300、350、400、450 W。

2.3.1 乙醇体积分数 由图1可知，乙醇体积分数在70%～90%范围内时，总黄酮提取率明显升高(P<0.05)，在90%时达到最大值，但在100%时略有降低；DPPH清除率随乙醇体积分数的变化趋势与总黄酮提取率呈现较好的一致性。因此，选择80%～100%作进一步优化。

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取率、DPPH清除率的影响

2.3.2 液料比 由图2可知，随着液料比升高，总黄酮提取率、DPPH清除率均大体呈先升后降的趋势，在40∶1时均达到最大值。因此，选择30∶1～50∶1作进一步优化。

图2 液料比对总黄酮提取率、DPPH清除率的影响

2.3.3 提取温度 由图3可知，随着提取温度升高，总黄酮提取率、DPPH清除率均呈先升后降的趋势，在30～50 ℃时两者一致性良好；在50 ℃后DPPH清除率急剧下降，总黄酮与提取率一致性较差，这可能是由于过高的温度在很大程度上破坏了具有体外抗氧化活性成分的结构，从而使其清除率显著降低。因此，选择30～50 ℃作进一步优化。

图3 提取温度对总黄酮提取率、DPPH清除率的影响

2.3.4 提取时间 由图4可知，提取时间对总黄酮提取率无明显影响。从节约成本、DPPH清除率角度考虑，选择30 min并不再作进一步优化。

图4 提取时间对总黄酮提取率、DPPH清除率的影响

2.3.5 提取功率 由图5可知，提取功率对总黄酮提取率无明显影响。从节约成本、DPPH清除率角度考虑，选择350 W并不再作进一步优化。

图5 提取功率对总黄酮提取率、DPPH清除率的影响

2.4 Box-Behnken响应面法 在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数(A)、液料比(B)、提取温度(C)作为影响因素，总黄酮提取率(Y1)、DPPH清除率(Y2)作为评价指标，采用Design-Expert 8.0.6软件安排试验，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平

表2 试验设计与结果

采用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行多元回归和二项式分析，得方程分别为Y1=83.68+18.59A+2.60B+2.50C-0.177 5AB+1.40AC-0.355 0BC-17.72A2-1.69B2-0.755 3C2、Y2=34.71+0.277 5A+0.788 8B+0.251 2C+0.775 0AB-0.025 0AC-0.532 5BC-3.16A2-2.49B2-2.13C2，方差分析见表3～4。由此可知，2个模型显著性均很强(P<0.01)，但失拟项均不显著(P>0.05)，表明其拟合度较好[19]；Y1、Y2相关系数r分别为0.992 9、0.987 2，表明自变量分别可反映99.29%、98.72%响应值的变化[20]；以Y1为响应值时，因素A、B、C、A2具有显著性(P<0.05，P<0.01)，说明A对其影响不仅是简单的线性关系[21]，而以Y2为响应值时，因素B、A2、B2、C2、AB、BC具有显著性(P<0.05，P<0.01)；各因素对Y1的影响程度依次为A>B>C，对Y2的影响程度依次为B>A>C。

表3 总黄酮提取率方差分析

表4 DPPH清除率方差分析

采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析，见图6～7。由此可知，乙醇体积分数与液料比、液料比与提取温度对DPPH清除率的交互影响较显著[22]；响应值均随着自变量的变化先升后降，但在各因素最高、最低水平之间等高线稀疏，响应曲面较缓和，故其所对应两因素之间的交互作用并不显著，与方差分析结果一致。

注：左图为三维曲面图，右图为等高线图。图6 各因素响应面图(总黄酮提取率)

注：左图为三维曲面图，右图为等高线图。图7 各因素响应面图(DPPH清除率)

2.5 验证试验 采用Design-Expert 8.0.6软件得到最优提取工艺为乙醇体积分数92.78%，液料比42.39∶1，提取温度41.18 ℃，总黄酮提取率为88.31%，DPPH清除率为34.63%，结合实际操作，将其修正为乙醇体积分数93%，液料比42∶1，提取温度41 ℃。按上述优化工艺进行3批验证试验，测得平均总黄酮提取率为(88.56±0.09)%，DPPH清除率为(34.52±0.15)%，与预测值88.31%、34.63%接近，表明该工艺稳定可行。

3 讨论

鉴于“成分反映活性，活性指向功能”的中药质量控制新模式，中药提取工艺的研究不应仅以其所含成分提取率为唯一评价指标，还应综合考虑其他相关因素，如活性、毒性等。同时，在中医药研究所需动物模型不完善的情况下，若采用活性成分提取率和体外活性整合的双指标评价方法，则可更综合全面地控制和优化中药提取工艺。因此，本实验以提取率与抗氧化活性为指标，通过双响应面法优化补骨脂总黄酮提取工艺，所得最优工艺参数稳定可行，不仅有利于该成分作为天然抗氧化剂，在食品、药品、化妆品、功能性食品、保健品等领域中的推广应用，也为其他中药提取工艺的研究提供了创新思路和方法。