天麻丸中独活虚假投料及羌活劣药投料的检测

张 伟， 吴孟华

(1.广州市药品检验所，广东 广州 510160；2.暨南大学药学院岭南传统中药研究中心，广东 广州 511443)

天麻丸收载于2020年版《中国药典》一部，处方含天麻60 g、羌活100 g、独活50 g、盐杜仲70 g、牛膝60 g、粉萆薢60 g、附子(黑顺片)10 g、当归100 g、地黄160 g、玄参60 g，剂型有水蜜丸、小蜜丸和大蜜丸，具有祛风除湿、通络止痛、补益肝肾的功效，用于风湿瘀阻、肝肾不足所致的痹病，症见肢体拘挛、手足麻木、腰腿痠痛。为控制天麻丸的质量，药典采用了不同的方法，例如用显微鉴别法检测天麻、玄参、盐杜仲、地黄、当归、牛膝、粉萆薢，薄层鉴别法检测天麻、羌活、当归、牛膝，HPLC法测定羌活和独活中天麻素、齐墩果酸含量。以异欧前胡素和蛇床子素的总量计，水蜜丸每1 g不得少于0.2 mg，小蜜丸每1 g不得少于0.13 mg，大蜜丸每丸不得少于1.2 mg[1]。

市售天麻丸价格参差不齐，部分存在中成药价格与药材成本倒挂的情况[2]。根据目前药典质量控制方法，除附子(黑顺片)外各组分均有定性或定量检测指标[3-5]，基本能较好地控制天麻丸质量。然而，羌活、独活、当归均为来自伞形科药材，以根入药，前两者主要含多种香豆素类成分，其中不乏同分异构体和结构相近者，容易相互干扰[6-8]。在药典天麻丸含量测定项下，以乙腈-0.1%磷酸(58∶42)为流动相等度洗脱，以异欧前胡素表征羌活，蛇床子素表征独活，结果以两者总量计[1]，但能否将羌活与独活中的数种香豆素类成分，尤其是同分异构体和结构相近者进行准确分离有待商榷。本研究采用HPLC法，结合单味饮片、阴性制剂、制剂的指纹图谱，对来自20家企业的184批市售天麻丸进行检测，该方法可对独活虚假投料和不含羌活醇的劣等羌活投料进行判断。

1 材料

Agilent1260液相色谱仪(美国Agilent公司)。异欧前胡素(批号110827-201109)、紫花前胡苷(批号111821-201102)、羌活醇(批号111820-201102)、蛇床子素(批号110822-201308)、藁本内酯(批号111737-201507)、二氢欧山芹醇当归酸酯(批号111583-200301)对照品及羌活(批号120935-201408)、宽叶羌活(批号121405-200401)、独活(批号120940-201111)、当归(批号120927-201516)对照药材均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

10家企业提供9批羌活饮片、9批独活饮片、10批当归饮片用于制备阴性制剂，具体见表1。

表1 用于制备阴性制剂的饮片信息

天麻丸总计184批，来自20家企业，规格为水蜜丸、大蜜丸，具体见表2。

表2 天麻丸信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 药典方法 Agilent SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.1%磷酸(58∶42)；柱温45 ℃；检测波长320 nm。理论塔板数按异欧前胡素峰计，应不低于20 000。

2.1.2 自拟方法 Phenomenex Kinetex C18色谱柱(100 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流动相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，程序见表3；体积流量1.2 mL/min；柱温30 ℃；检测波长320 nm。

表3 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液制备

2.2.1 药典方法 精密称取异欧前胡素、蛇床子素对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含两者10 μg的溶液，即得。

2.2.2 自拟方法 精密称取紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素、蛇床子素、藁本内酯对照品适量，甲醇制成每1 mL各含五者10 μg的溶液；精密称取二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，甲醇制成每1 mL含10 μg该成分的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 取水蜜丸适量，研碎，混匀，精密称取1 g;取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，精密称取5 g，精密加入硅藻土5 g，研匀，精密称取4 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，浸泡过夜，超声(功率250 W、频率40 kHz)处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性制剂制备 按2020年版《中国药典》天麻丸项下制法(“以上十味，粉碎成细粉，过筛，混匀。每100 g粉末用炼蜜40～50 g加适量的水泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加炼蜜90～110 g制成小蜜丸或大蜜丸”)，分别制备缺羌活、缺独活、缺当归的阴性制剂。

2.5 方法学考察 取样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下进样测定，测得各共有峰保留时间的重复性、精密度、稳定性(24 h)RSD均小于1.5%，峰面积三者RSD均小于4.1%，表明该方法精密度、重复性良好，溶液在24 h内稳定性理想。

2.6 图谱分析

2.6.1 药典方法 取184家企业32批大蜜丸、152批水蜜丸，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，蛇床子素于19.5 min左右出峰，异欧前胡素于20.5 min左右出峰，两者分离度良好，但峰形均较矮胖，无法确定是否有未分离的其他色谱峰。

1.蛇床子素 2. 异欧前胡素1.osthole 2.isoimperatorin图1 各成分HPLC色谱图(药典方法)Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents (pharmacopoeia method)

2.6.2 自拟方法

2.6.2.1 大蜜丸 分别取5家企业32批大蜜丸，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下进样测定，色谱图见图2，指纹图谱见图3，再将图谱数据导入“科迈恩(北京)科技有限公司Chempattern化学计量学系统软件”[9-11]，计算相似度，结果见图4。由此可知，除DFH的1批样品相似度为0.57外，其余均大于0.9，可能是缺失羌活醇所致。

2.紫花前胡苷 10.藁本内酯 11.羌活醇 12.蛇床子素13.异欧前胡素2.nodakenin 10.ligustilide 11.notopterol 12.osthole 13.isoimperatorin图2 大蜜丸中各成分HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents in big honeyed pills

2.6.2.2 水蜜丸 取17家企业152批水蜜丸，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下进样测定，色谱图见图5，指纹图谱见图6，将图谱数据导入“科迈恩(北京)科技有限公司Chempattern化学计量学系统软件”[9-11]，计算相似度，结果见图7。由此可知，水蜜丸分为2组，1组13个共有峰(A组)，另1组12个共有峰(B组)，A组以相似度0.8为界，高于0.8的为A1，低于0.8的为A2(主要为TSL样品，可能是因为紫花前胡苷含量不稳定，变化较大所致)；B组为12个共有峰(相似度均低于0.8，主要集中在HBRH、XJTL-1、YJD、SCDQ、JHT、GZL、GZSJ、JLSS、TSL，可能缺失羌活醇)。同时，对LSZ、HBRH、XJTL-1、LSL样品数大于10批的企业分别计算相似度，发现LSZ所有批次样品相似度均大于0.95；HBRH有3批低于0.75，显示为离群样品，其余均大于0.95；XJTL-1有部分批次大于0.95；TSL有7批大于0.90，3批小于0.70，可能缺失羌活醇。

2.紫花前胡苷 10.藁本内酯 11.羌活醇 12.蛇床子素13.异欧前胡素2.nodakenin 10.ligustilide 11.notopterol 12.osthole 13.isoimperatorin图5 水蜜丸中各成分HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of various constituents in water-honeyed pills

图6 152批水蜜丸HPLC指纹图谱Fig.6 HPLC fingerprints for one hundred and fifty-two batches of water-honeyed pills

图7 152批水蜜丸相似度分布Fig.7 Similarity distribution for one hundred and fifty-two batches of water-honeyed pills

2.7 原料药材归属 取羌活、独活、当归对照药材及各饮片阴性制剂适量，按“2.3”项下方法制备相应溶液，在“2.1.2”项色谱条件下进样测定，对保留时间一致、阴性制剂供试品溶液中未出现的色谱峰进行分析，再根据紫外光谱信息，对全方中与对照药材指纹图谱中的相关色谱峰进行归属。结果，天麻丸中有13个特征峰，峰1～2、11、13归属于羌活(2020年版《中国药典》羌活药材项下有2个基原，分别为羌活、宽叶羌活，在色谱图中发现两者相差较大，羌活醇、异欧前胡素为共有峰)，见图8；峰3～7、12归属于独活，见图9；峰10归属于当归，见图10。以二氢欧山芹醇当归酸酯为参照[12-13]，出峰时间为47.8 min左右，为独活特征性成分之一，但在其阴性制剂中有干扰，故未作为特征峰进行考察。

2.紫花前胡苷 11.羌活醇 13.异欧前胡素2.nodakenin 11.notopterol 13. isoimperatorin图8 各样品HPLC指纹图谱(Ⅰ)Fig.8 HPLC fingerprints for various samples (Ⅰ)

12.蛇床子素12.osthole图9 各样品HPLC指纹图谱(Ⅱ)Fig.9 HPLC fingerprints for various samples (Ⅱ)

10.藁本内酯10.ligustilide图10 各样品HPLC指纹图谱(Ⅲ)Fig.10 HPLC fingerprints for various samples (Ⅲ)

2.8 独活虚假投料检出 XJTL-2(批号13030003、13030004)、XJTL-1(批号141101)未检出独活特征峰及蛇床子素，见图11，故判定未投料独活。

注：A～D分别为XJTL-2(批号13030003)、XJTL-2(批号13030004)、XJTL-1(批号141101)、 LSZ。1.蛇床子素1. osthole图11 独活虚假投料、真实投料天麻丸HPLC指纹图谱Fig.11 HPLC fingerprints for Tianma Pills fakely and truely fed with Angelicae pubescentis Radix

3 讨论

3.1 检测波长选择 采用DAD检测器在220、280、320、360 nm波长处测定，发现220、320 nm处的峰强度和数量较多，由于220 nm靠近紫外吸收末端，故在320 nm处检测香豆素类(紫花前胡苷、蛇床子素、异欧前胡素)及藁本内酯类成分，结果均有较高的响应值，表观强度较好，同时香豆素类成分稳定，基本不随时间的变化而降解。

3.2 色谱柱选择 天麻丸中香豆素较多，5 μm粒径色谱柱分离度有限，故考察Agilent poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)、Phenomenex Kinetex C18(100 mm×4.6 mm，2.6 μm)小粒径色谱柱[14-15]，结果后者分离效果较好。

3.3 天麻丸生产投料问题 5家企业32批大蜜丸中，1家企业有1批相似度低，发现其不含羌活醇，但归属于羌活的1、2、13号峰均有出现；17家企业152批水蜜丸中，也有2个企业48批出现上述情况。根据以上制剂样品的生产时间推测，购入羌活药材时执行2010年版《中国药典》，仅要求羌活中羌活醇和异欧前胡素总量不得少于0.40%，但2015、2020年版《中国药典》新增特征图谱，对羌活醇色谱峰的出现有明确要求，故此类不含羌活醇的羌活饮片不得再作为处方投料使用。羌活醇的稳定性欠佳，羌活长时间暴露在空气中时其含量会有所降低，导致药材质量下降[16]，无法满足2015年版《中国药典》要求。因此，建议企业在生产投料时不宜使用放置过久的该药材。

17家企业152批水蜜丸中，有3批相似度小于0.8，发现其不含蛇床子素，同时归属于独活的3、4、5、6、7、12号峰均缺失，判断独活均未投料，但如按2020年版《中国药典》方法检测，各项均符合规定。含量测定结果显示，天麻丸[XJTL-2(批号13030003、13030004)]两者总含量均为0.5 mg/g，XJTL-1(批号141101)天麻丸异欧前胡素和蛇床子素总含量为1.0 mg/g，均远高于药典“水蜜丸每1 g不得少于0.2 mg”的规定。因此，药典方法检测为合格的样品若按照本研究自拟方法，可准确判断独活为虚假投料，系“合格的假药”。

3.4 独活虚假投料判断 独活具有祛风除湿、通痹止痛的功效，通常与羌活形成药对在处方中使用[17]。羌活解表力佳，善治上半身痹痛，为止头痛要药[18]；独活则解表力缓，善治下半身痹痛[19]，天麻丸中二药合用，以行除全身之痹的功能。独活虚假投料对天麻丸的功效影响很大，本研究所建立方法可很好地判断是否如此。建议下一版《中国药典》增加天麻丸特征图谱，同时对化学结构类型相近、成分多样化的药材采用小粒径色谱柱、多检测器联用等方式，增加特征性的指纹图谱鉴别来杜绝虚假投料和劣药投料，从而控制中成药的质量。