UPLC法同时测定双黄升白复方中11种成分

覃艳虹， 江 旻， 张 彤,2， 许陈思涵， 杨 骏， 丁 越,2*

(1.上海中医药大学中药学院，上海 201203；2.上海中医药大学教学实验中心，上海 201203；3.上海市黄浦区香山中医医院药剂科，上海 200020)

骨髓抑制是多数化疗药的常见毒性反应，常导致化疗中断或并发感染[1-3]。双黄升白复方为龙华医院治疗化疗后髓抑制的经验方[4]，可促进造血干细胞增殖，改善骨髓造血微环境[5-7]，由黄芪、黄精、女贞子、天花粉、骨碎补、淫羊藿组成, 功效益气养阴、补肾生髓[8-9]。方中黄芪具有多种活性成分，如黄芪甲苷、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷等[10]，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷为主要代表[11]；黄精主要成分为黄精多糖，具有调节血糖血脂、增强免疫力等功效[12]；女贞子主要的苯乙醇类成分为红景天苷[13]，并且2020年版《中国药典》规定其含量不得低于0.7%[14]；骨碎补主要成分包括柚皮苷、新北美圣草苷等，其中柚皮苷为2020年版《中国药典》规定检测成分[15]，具有抗氧化、清除自由基等药理作用[16]；天花粉主要成分为多种氨基酸[17]；淫羊藿中总黄酮醇苷具有促进造血功能、强化免疫等功效[18]，2020年版《中国药典》规定其含量不得低于1.5%。

目前，对双黄升白复方主要成分含量测定的报道较少，仅石秀峰等[19]通过测定淫羊藿苷(HPLC法)、黄芪甲苷(紫外法)含量来比较颗粒2种纯化工艺，但以上2种成分需分别检测，耗时较长。本实验采用UPLC法同时测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ、红景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女贞苷、芒柄花黄素的含量，以期为该制剂全面质量控制提供技术支撑。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 series超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；BS124S电子天平(德国赛多利斯公司)；XS105DU电子天平[梅特勒-托利多仪器(中国)有限公司]。

1.2 试剂与药物 特女贞苷(批号200006-202001，纯度98.7%)、新北美圣草苷(批号240079-202006，纯度98.2%)、朝藿定A(批号030050-202006，纯度99.2%)、朝藿定B(批号260078-202006，纯度98.6%)、朝藿定C(批号030049-201912，纯度98.2%)对照品均购自上海鸿永生物科技有限公司；宝霍苷Ⅰ(批号R11M8F31212，纯度98.3%)、红景天苷(批号N26A11X111127，纯度98.2%)、淫羊藿苷(批号Z11D5B1，纯度98.6%)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号Y27F9H54731，纯度99.9%)、柚皮苷(批号H24N9Z75896，纯度98.9%)、芒柄花黄素(批号H06S9Z69494，纯度99.9%)对照品均购自于上海源叶生物科技有限公司。黄芪(批号200915，产地甘肃)、黄精(批号200711，产地湖南)、女贞子(批号200908，产地湖南)、骨碎补(批号190422，产地广东)、天花粉(批号200718，产地河南)、淫羊藿(批号200928，产地陕西)均由上海康桥中药饮片有限公司提供，经上海中医药大学教学实验中心丁越研究员鉴定为正品。95%乙醇(分析纯，批号20200812，国药集团化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯[中国医药(集团)上海化学试剂公司]。

2 方法和结果

2.1 提取液制备

2.1.1 醇提液 取6味组方药材共150 g(生药量)，加10倍量55%乙醇回流提取3次，每次1 h，回收乙醇，浓缩至1∶1，即得。

2.1.2 水提液 按照处方，取生黄芪、黄精等6味药材共150 g(生药量)，10倍量水煎煮3次，合并水提液，过滤后浓缩至1∶1，即得。

2.1.3 水提醇沉液 量取50 mL水煎提取浓缩液，加无水乙醇调至醇体积分数为80%，密封，冷藏24 h后取出，滤过，滤液浓缩，80%乙醇定容至50 mL量瓶中，即得。

2.1.4 阴性样品 按照处方，分别制得缺黄芪、缺骨碎补、缺女贞子、缺淫羊藿的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2 供试品溶液制备 精密吸取浓缩液1 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇混匀、定容，进样前用0.2 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，置于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，制成含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.086 mg/mL、朝藿定A 0.095 mg/mL、朝藿定B 0.480 mg/mL、朝藿定C 0.204 mg/mL、淫羊藿苷0.756 mg/mL、宝霍苷Ⅰ 0.044 mg/mL、红景天苷0.943 mg/mL、新北美圣草苷0.535 mg/mL、柚皮苷1.122 mg/mL、特女贞苷0.952 mg/mL、芒柄花黄素0.003 5 mg/mL的溶液(已按其纯度折算)，即得，室温避光保存。

2.4 色谱条件 Aglient Eclipse Plus C18RRHD色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)；流动相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.3 mL/min；不设柱温；检测波长270 nm(毛蕊异黄酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ)、280 nm(红景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷)、254 nm(特女贞苷、芒柄花黄素)；进样量2 μL。

2.5 专属性试验 精密吸取对照品、供试品溶液适量，在“2.4”项色谱条件下进样测定，结果见图1～3。由此可知，各成分色谱峰分离度均大于1.5，附近无其他杂质峰干扰，表明该方法专属性良好。

表1 梯度洗脱程序

1.毛蕊异黄酮葡萄糖苷 2.朝藿定A 3.朝藿定B 4.朝藿定C5.淫羊藿苷 6.宝霍苷Ⅰ 1.calycosin-7-glucoside 2.epimedin A 3.epimedin B 4.epimedin C 5. icariin 6.baohuoside I图1 各成分UPLC色谱图(270 nm)Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents (270 nm)

7.红景天苷 8.新北美圣草苷 9.柚皮苷7.salidroside 8.neoeriocitrin 9.naringin图2 各成分UPLC色谱图(280 nm)Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents (280 nm)

10.特女贞苷 11.芒柄花黄素10.nuezhenide 11.formononetin图3 各成分UPLC色谱图(254 nm)Fig.3 UPLC chromatograms of various constituents (254 nm)

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 取“2.3”项下对照品溶液，50%甲醇稀释，在“2.4”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，信噪比(S/N)3、10分别为最低检测限、最低定量限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.6.2 精密度试验 取高、中、低质量浓度对照品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定6次，连续3 d，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ、红景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女贞苷、芒柄花黄素日内精密度RSD分别为0.1%～2.3%、0.1%～3.1%、0.1%～1.1%、0.1%～3.0%、0.1%～1.3%、0.1%～2.8%、0.1%～2.4%、0.2%～2.3%、0.1%～1.6%、0.3%～1.5%、0.2%～6.8%，日间精密度RSD分别为0.3%～1.8%、0.6%～3.5%、0.7%～4.5%、0.7%～3.6%、0.6%～4.1%、3.1%～3.6%、0.4%～3.4%、3.0%～1.2%、0.5%～4.2%、0.9%～4.4%、0.4%～4.2%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 取水提浓缩液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ、红景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女贞苷、芒柄花黄素峰面积RSD分别为1.5%、1.0%、1.1%、0.2%、0.3%、0.8%、0.5%、0.6%、0.8%、2.2%、3.0%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.4 重复性试验 精密吸取水提浓缩液1 mL，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ、红景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女贞苷、芒柄花黄素含量RSD分别为0.4%、0.6%、1.5%、1.4%、1.2%、2.7%、1.0%、0.8%、1.1%、0.5%、4.9%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验 精密移取各成分含量已知的水提浓缩液9份，每份0.5 mL，分别加入80%、100%、120%水平对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ、红景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女贞苷、芒柄花黄素平均加样回收率分别为102.41%、102.99%、104.21%、102.51%、103.85%、102.90%、104.24%、99.25%、102.16%、104.01%、102.57%，RSD分别为1.0%、0.4%、1.4%、1.4%、0.8%、0.8%、0.6%、0.7%、0.5%、0.7%、0.7%。

2.7 样品含量测定 取3种提取方法所得浓缩液适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算含量，再采用t检验进行统计学分析，结果见表3。

表2 各成分线性关系

3 讨论

3.1 检测指标筛选 黄芪主要有效成分为黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷，2020年版《中国药典》规定，前者含量不得低于0.080%，本实验先选择毛蕊异黄酮葡萄糖苷。黄精、天花粉有效成分分别为多糖、氨基酸，两者紫外检测前均需进行衍生化，而且方法不同，故今后将对其质量评价方法进行改进；特女贞苷、红景天苷、宝霍苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、柚皮苷为2020年版《中国药典》中女贞子、淫羊藿、骨碎补的质量控制指标，故本实验重点考察以上8种成分。此外，双黄升白复方中芒柄花黄素、新北美圣草苷含量较高，故将两者也纳入检测指标。

表3 各成分含量测定结果

3.2 色谱条件筛选 本实验先采用二极管阵列检测器(DAD)，在200～600 nm波长处进行扫描，并结合 2020年版《中国药典》，最终确定为270、280、254 nm。再比较水-甲醇、水-乙腈洗脱时色谱分离情况，发现后者分离度更高，峰对称度更好，故选择其作为流动相。然后考察了不同体积流量(0.2、0.25、0.3、0.4 mL/min)、柱温(25、30、35 ℃)对色谱峰峰形、分离度、基线的影响，发现不同柱温均无明显影响，最终确定体积流量为0.3 mL/min，不设柱温，进样量为2 μL。

3.3 不同提取液中各成分含量比较 朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、红景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女贞苷是双黄升白复方水提液、醇提液主要成分，并且前者中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、新北美圣草苷含量分别为后者中的1.2、1.4、1.2倍，而后者中宝霍苷Ⅰ、特女g贞苷含量分别为前者中的1.5、1.5倍。另外，该方水提醇沉液澄清度明显提高，但各成分含量均降低。

4 结论

本实验建立UPLC法同时测定双黄升白复方中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ、红景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女贞苷、芒柄花黄素的含量，通过方法学考察发现该方法精密度、重复性、稳定性均良好，符合中药分析要求。今后，将采用UPLC法进一步考察双黄升白复方新药生产的制备工艺。