全外显子测序检测6个囊性肾病胎儿及其核心家系的致病突变*

周 静，马定远，吴 云，杨 玲，朱爱红，李 璃，罗春玉，张菁菁，胡 平，许争峰

(南京医科大学附属妇产医院产前诊断中心，南京 210004)

囊性肾病是一种较常见的胎儿发育异常，主要由于肾脏诱导和分化的缺陷，囊性组织代替了肾脏实质。囊性肾病的临床特征为超声可见的胎儿单侧或双侧出现一个或多个囊性病变，可同时伴随羊水过少或无羊水，以及其他肾外表现。导致囊性的原因很多，遗传因素是重要的一部分。鉴于胎儿囊性肾病突出的遗传异质性和不同基因序列结构的差异较大，突变基因的检测和致病性的确立较为复杂和具有技术挑战性。本研究运用家系全外显子检测结合Sanger测序技术，对CMA结果阴性、排除了综合征性囊性肾病的6个胎儿及其核心家系进行检测，寻找基因水平可能的致病性变异。

1 资料与方法

1.1 资料来源 收集2015年1月1日至2020年12月就诊于南京市妇幼保健院产前诊断中心，6个因胎儿囊性肾病(图1)要求基因诊断的家系，因孕期(妊娠16+5～35+5周)超声提示胎儿为囊性肾病终止妊娠(1例为晚期妊娠因双肾多囊样发育不良经多学科会诊同意终止妊娠)，经知情同意，采集胎儿皮肤标本和父母外周血标本。本研究经南京市妇幼保健院伦理委员会批准。

图1 囊性肾病胎儿肾脏超声图A:病例1;B:病例2;C:病例3；D:病例4;E:病例5;F:病例6

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 经知情同意采集胎儿皮肤标本2cm×2cm×2cm和父母外周血5mL，分别使用恺硕组织样品和血液基因组DNA提取试剂盒，按操作流程提取DNA，NanoDrop2000分光光度仪测定DNA浓度，所有DNA浓度>100ng/μL，吸光度A260nm/A280nm为1.8～2.0。

1.2.2 构建文库和家系外显子测序 Covaris超声波DNA破碎仪将提取的胎儿组织和双亲外周血基因组DNA片段化为150～200bp大小，末端修复，加腺苷尾，连接接头，PCR扩增得到基因组DNA文库。使用安捷伦SureSelectXT目标富集系统杂交、外显子捕获、PCR扩增后，在Illumina Hiseq2500测序平台进行高通量测序。实验流程中的质控均符合要求，最终文库质量符合要求。

1.2.3 生物信息学分析 测序所得原始数据经去接头、去重复和过滤，有效数据经国际和国内有共识的公共数据库比对，按遗传模式、发病时间、突变的人群频率、危害性预测分析等，再将基因功能通过OMIM、HGMD、NCBI等数据库进行搜索，根据ACMG(2015)及补充要求、ClinGen序列变异解释专家组对指南标准的应用建议，选择与表型相关性较大和致病可能性较高的位点进行分析，得出结论。

1.2.4 Sanger测序验证目的基因 对分析获得的目标基因进行一代测序验证。运用NCBI在线软件设计引物。PCR扩增后测序获得家系目标基因序列。

2 结 果

2.1 外显子捕获和生物信息学分析结果 3个家系检出异常突变，其中1个家系的突变为遗传性，2个家系胎儿的变异为新发突变；余3个家系未检出明确致病突变，其中1个家系检出2个遗传性临床意义不明的突变伴随子代有一个位点为纯合突变。见表1。胎儿2和胎儿3均未检测到明确致病突变。

2.2 Sanger测序验证 对外显子捕获测序检测的目标基因，再对胎儿及父母的基因组DNA标本行Sanger测序及验证，结果与WES结果一致。见图2。

表1 胎儿1、4、5、6 Trios-WES检测结果

3 讨 论

胎儿肾脏囊性病变(renal cystic disease)为常见的胎儿超声异常，包括单发性肾囊肿、多发性肾囊肿、多囊肾、多囊性肾发育不良等，肾脏的发育异常可以孤立存在，也可以合并其他超声异常。单个囊肿，囊壁光滑，与肾脏集合系统不相连为单发性肾囊肿[1]。多个囊肿，之间有分隔，囊壁光滑有完整被膜，与肾脏集合系统不相连为肾多发囊肿。囊肿较大时可引起正常肾组织受压或萎缩，需手术治疗。婴儿型多囊肾(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)，为常染色体隐性遗传，因肾脏皮髓质的多发微小囊肿，超声探头发送的超声波在囊肿之间的界面反射，导致回声增强；双侧肾脏对称性增大，实质内充满扩张的集合管[2]，皮质髓质界限无法区分；合并羊水减少时，提示肾功能严重受累，围产儿预后差。也可发生于儿童和成人，起病后通常结局不好[3]。成人型多囊肾(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一种常染色体显性遗传病，表现为肾实质回声增强，肾区内多个大小不等的囊肿[4-5]，皮髓质界限清楚，常有双亲一方多囊肾病史，主要致病基因为PKD1和PKD2[6]。当肾内单侧、双侧或仅局限于某一部分出现大小不一、数量不等的囊腔[7]，为多囊性肾发育不良(multicystic dysplastie kidney disease,MCDK)，又称多囊泡肾，发病率约为1/2500，肾内大小不等的囊肿互不相通，肾脏体积增大[8]，为胚胎发育早期输尿管芽诱导后肾原基发育过程受阻所致，少数为遗传疾病[9]。单侧MCKD，如果羊水量正常，另一侧肾脏超声影像正常，可在出生后行患侧肾脏切除手术治疗，临床预后较好[10]。双侧肾脏病变时，肾脏体积小、发育不良，羊水显著减少甚至无羊水，预后不良。绝大多数的MCDK可在产前超声检查时诊断[11]。囊性肾病在1986年由Bosniak根据囊肿的数目、厚度、有无间隔等特征分为四级[12]。

各种囊性肾病的起病原因不同[13-14]，遗传性因素为重要的一部分，可能为染色体微缺失微重复综合征，也可能为基因水平的致病突变所致。在基因水平，结合各种测序技术，已发现了超过100余种参与囊性肾病的突变基因[15]。

目前检测囊性肾病致病基因的方法主要有：已知目标基因的直接检测、拷贝数变异(copy number variant，CNV)检测、全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)和全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)。当一对夫妻因为一方患病或曾有过一胎诊断为囊性肾病，可以对先证者进行遗传学检测。如果能获得有意义的检测结果，可帮助他们进行产前诊断或植入前诊断以得到一个健康的孩子。因为存在遗传异质性，该病的致病基因或者致病的染色体的微缺失微重复很难通过一种传统的遗传检测方法直接找到或者确定。

WES检测基因组中的编码区域，人类外显子组区域约占全基因组序列的1%～2%，覆盖约85%的已知致病基因突变位点[16]。WES既可检测已知的疾病相关基因致病位点，又可发现新的疾病相关位点和新的疾病相关基因。外显子组测序以患者-双亲的核心家系模式为主，有助于提高新发突变在疾病中的检出率[17-19]。美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)在2020年的规范中指出产前超声存在明确结构异常的胎儿，若核型和CMA检测结果无异常，推荐核心家系3人组全外显子组测序(Trio-WES)检测[20-21]。Petrovski等[21]研究报道，WES在胎儿各个系统包括肾脏系统畸形中有较高的检出率。相较于一般检测深度的WGS，WES具有检测成本较低、对样本DNA的需求量较小、数据信息分析难度较之WGS低以及外显子区域测序深度更有保证等优势。在胎儿结构异常其核型和CMA检测阴性结果的病例中，WES可额外检出约10%的致病性基因变异[22-23]。

本研究运用WES结合Sanger测序对CMA结果未见明显异常的胎儿囊性肾病的6个家系样本进行检测，旨在单基因水平寻找可能的致病突变。胎儿1 检测到PKHD1基因存在c.5869G>A和c.9455delA复合杂合突变，分别遗传自父亲和母亲，目前均无相关文献报道，在千人基因组和dbSNP 138多态位点数据库未见记载，生物信息学分析表明可能影响PKHD1功能，后者使PKHD1基因的编码信息发生错误，可能使编码的蛋白质提前终止，从而表达截短形式的蛋白质，根据胎儿及其父母的检测结果，并结合临床表现，胎儿的基因型c.5869G>A/c.9455delA，均为可疑致病突变，可能导致多囊肾病，其功能和致病性均需进一步验证。胎儿4检出2个可能与疾病有相关性的突变：PKHD1基因c.8791C>T突变，1000 Genomes、ExAC和gnomAD人群数据库中均无记载，也未见文献资料报道，属于罕见突变。根据ACMG遗传变异分类标准和指南，评估为临床意义不明的突变，且仅这一个杂合变异不能导致多囊肾病。PKD1基因第15号外显子c.5483A>G突变，1000 Genomes、ExAC和gnomAD人群数据库中的发生频率分别为0.0002、0.0003和0.0002，在gnomAD人群数据库东亚人群中的发生频率为0.003，且仅在东亚人群中发现，该突变在PKD Mutation Database数据库已收载，临床意义记录为不明确，根据ACMG遗传变异分类标准和指南，评估为临床意义不明的突变。但胎儿PKD1基因存在c.5483A>G纯合突变，而父亲为杂合突变，其母亲该位点为野生型，胎儿是纯合子的现象可能与单亲二倍体有关。故该病例未发现明确致病的变异。胎儿5HNF1B基因存在c.826C>T杂合突变，为无义突变，可致氨基酸序列发生p.Arg276X改变，该突变为已有报道的致病性突变[24-25]，父母不携带，为胎儿新发突变。胎儿6HNF1B基因存在c.1318G>T杂合，为无义突变，可导致氨基酸序列发生p.Gly440X改变，评估该突变为可能致病突变，目前无相关数据库报道，需要进一步实验验证，为胎儿新发突变。

胎儿2、3、4检出的数据经过详尽分析后未找到明确致病突变，可能由于WES检测技术的局限性、目前数据库积累的数据不够或者生物信息分析方法的不够完善，也可能需要更新的技术手段去实现遗传性致病因素的检出，随着诊疗技术日益更新，在不远的将来，这些病例可能在更多的平台去寻找病因。

选择经CMA为阴性结果的病例，运用全外显子技术寻找可疑致病位点，随后一代测序对推测与表型相关的位点进行验证。利用全外显子组测序分析技术对先证者进行致病基因突变检测，其灵敏度和特异度均较好。病例中检出的PKHD1和HNF1B均为已知的可致囊性肾病的基因[26-27]。PKHD1编码纤维胱氨酸，在肾集合管、胆管、上皮细胞和胰腺的初级纤毛中表达。纤维胱氨酸缺乏可导致肾集管和肝内胆管的终末分化、扩张和纤维化[28]，以致肾脏和肝脏的纤维囊性改变，不同的基因突变位点引起的临床表现有所不同[29]，至今已经报道了750多个PKHD1突变，其中约60%为截断突变，40%为错义突变。HNF1B杂合子突变可导致复杂的综合征性囊性肾病和糖尿病，其特征是肾脏、尿道、生殖道、胆道和胰腺发育异常或功能障碍和糖尿病早发。导致的肾脏异常包括单侧或双侧囊肿、多囊发育不良、发育不全肾小球囊性肾病等[30]。目前已有超过150个HNF1B杂合突变被报道，包括错义、无义、插入/缺失、移码和剪接位点突变以及全基因缺失。本研究3个新的可能致病突变位点的发现丰富了这两个基因的突变谱。越来越多的基因被认为与囊性肾病相关，这个传统技术难以解决的问题，很大程度上得益于基于下一代测序的方法，目标基因的平行分析大大提高了检出率。精准的遗传学诊断对遗传咨询和产前诊断都非常重要，为致死性囊性肾病史的家庭提供胚胎移植前诊断的可能性。WES可以将其作为一线检测手段之一，有利于疾病致病基因库的建立，为将来基因治疗靶向位点建立基础。

WGS对基因组DNA进行检测，能对外显子、内含子和基因间序列均能覆盖，但因不同类型胎儿发育异常的表型基因型数据不够充分，WGS用于产前遗传学病因诊断尚待时日。家系WES检测技术仍是目前先天性结构异常患者寻找遗传性因素的一线选择。