大鼠单侧耳蜗损伤后下丘中GluR2/3受体的变化

楚铜 金晓杰

谷氨酸为哺乳动物神经系统重要的兴奋性及伤害性神经递质，在中枢重组过程中起到至关重要的作用。α-氨基-3-羧基-5-甲基异唑-4-丙酸(alpha-amino-3-hydoxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate, AMPA)受体是一种离子型谷氨酸受体(GluR)，通过快钠通道的激活和失活，介导哺乳动物中枢神经系统兴奋性谷氨酸的快速传递。AMPA受体分为GluR1～4四个亚型，其特性主要由对钙离子不通透的GluR2亚型所决定，而且大多以GluR2/3形式存在[1]。下丘是听觉通路中最原始的融合中枢，也是对声音信息进行加工处理和传递的最重要的中继核团[2]，但其在听觉中枢重组中的变化仍有待研究,因此，本研究拟通过观察大鼠单侧耳蜗损伤后短期内GluR2/3在下丘中的变化，以期对单侧耳蜗损伤后听觉中枢重组的分子机制研究提供进一步参考。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 体重300±50 g的健康 SD大鼠36只，耳廓反射灵敏，雌雄不拘，随机分为9组，分别为造模术后2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、3 d、7 d组以及健康对照组，每组4只。

1.2单侧耳蜗损伤造模 将前8组(术后2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、3 d、7 d组)动物水合氯醛腹腔麻醉(3 ml/kg)后，固定在操作台上，于右耳做耳后切口，暴露出听泡。将听泡打开，暴露耳蜗，打开并破坏耳蜗各回，吸除内外淋巴液，随后注入无水乙醇，明胶海绵填塞止血。最后将伤口缝合，行听性脑干反应检测，确认单侧耳蜗损伤动物造模完成；动物于亮处复苏；健康对照组不做处理。

1.3各组动物下丘取材 前8组动物至预定时间点腹腔深麻醉后，于腹主动脉处生理盐水快速灌注至右心房流出液清亮,改为4%多聚甲醛PBS液缓慢灌注至头颈变硬(持续约30分钟)，断头，取出脑干，于大脑背面四叠体中央作一冠状切面，切除上丘及部分大脑，将下丘及脑干置于多聚甲醛中后固定4～6小时，包埋，肉眼下定位下丘(为四叠体下方的两个球形结构)[3]，从头向尾侧作连续冠状切片,片厚5 μm，隔4张取1张。对照组以同法取材。

1.4免疫组化染色 一抗为2.5 μg/ml兔抗鼠GluR2/3多克隆抗体溶液，二抗为1∶80羊抗兔FITC-IgG，均为upstate公司产品。将经过脱蜡、复水、修复等处理的切片滴加配制好的一抗，放入4 ℃的冰箱过夜，然后滴加二抗，室温下反应30分钟后即可封片，在荧光显微镜下观察，阳性染色为黄绿色荧光。

1.5显微图像分析 以采用德国Leica Qwin 图像处理与分析软件进行图像分析。于每个视野内随机截取相同大小的面积，检测该视野内所有阳性神经元荧光灰度值，该荧光灰度值减去背景灰度值的差比背景灰度值即为该测量点的相对灰度值。

1.6统计学方法 在SAS软件(SAS6.12版,美国SAS软件研究所)下完成数据的统计分析。样本间的两两比较采用T检验,比较耳蜗毁损术后不同时段GluR2/3在听觉中枢的分布。

2 结果

在低倍荧光显微镜下可以观察到，下丘大部分细胞均为免疫阳性，呈黄绿色荧光，与背景区别明显；中央核的背外侧部以圆形和梭形细胞为主，突起较多；而中央核的腹内侧部则以小圆形或多角形细胞为主 ，突起较少(图1)。在高倍荧光显微镜下可观察到，在下丘大部分神经元中GluR2/3免疫阳性沉积物主要位于胞膜、膜周胞浆以及突触上，而胞核及核周胞浆的表达较弱或无表达，因此大部分细胞呈圈状或环状(图2、3)。各组下丘神经元的免疫荧光灰度值见表1，手术各组术侧下丘中GluR2/3受体相对灰值比较、各组术侧与健侧比较、手术组与对照组比较，差异均无统计学意义(均为P> 0．05)。对照组下丘中GluR2/3受体相对灰度值在核细胞浆为0.2611±0.0574,膜细胞浆为0.6543±0.0467。

表1 术后不同时间术侧与健侧下丘神经元的GluR2/3免疫反应灰度值

3 讨论

下丘为听觉通路上重要的中继站，以往研究发现完全破坏单侧耳蜗后2小时，即可观察到术侧的蜗核神经元中GluR2/3受体出现明显变化[4]，推测是由于声音信号的变化导致细胞内受体的合成和转运也相应变化[5,6]。然而本研究用同样方法，并未观察到造模术后2 h、4h、6h、8h、12h、24h、3 d、7 d各组间术侧、健侧以及健康对照组的下丘中GluR2/3受体表达的明显变化。文献报道下丘中的纤维可来自于耳蜗背侧、腹侧核、上橄榄中间核、外侧核、上橄榄旁核、外侧丘系等；下丘中央核团至少接受来至低位的四个不同听觉核团的同侧和对侧投射，显示其调节机制的复杂性[7]，推测本研究结果产生的原因可能由于蜗核只有上行纤维，且只接受同侧的信号传入，因此当单侧耳蜗破坏后，术侧蜗核的变化明显且迅速；而下丘除了接收来自同侧上行神经纤维也接收对侧的上行神经纤维，健侧的听觉传导通路并未变化，健侧的听皮层等继续投射正常信号于下丘，因此短时间内术侧下丘仍能通过这些交叉纤维接收到健侧传入的正常信号；并且下丘还接受来自双侧上级神经核团的传出神经的支配，故术侧下丘中GluR2/3表达的变化不明显；但也可能与本研究单侧耳蜗损伤造模术后观察时间短有关。

已有报道证实单侧听觉剥夺后，可观察到听皮层及下丘神经元中CREB和NMDAR1[8]、GAP-43[9]原癌基因及凋亡相关基因表达的变化[10]；上橄榄核神经元数量减少[11]，中脑以及下丘神经元的方向敏感性明显降低[12]等，但上述结果均在术后2～4周后才观察到。本研究于单侧耳蜗毁损后短时间内(7 d内)未观察到术侧蜗核神经元中GluR2/3表达的变化，可能由于神经交叉，蜗核以上的诸神经核团神经元中的GluR2/3变化需要更长的时间才能观测到。