痂状炭角菌鉴定、培养条件优化及发酵产物活性分析

王丽芳，毛炯炳，彭 耀，董育德，郝艳佳，毛伟光，党向利

(1 安徽农业大学 园艺学院，安徽 合肥 230036； 2 安徽农业大学 植物保护学院，安徽 合肥 230036；3 绍兴市曙光科技开发有限公司，浙江 绍兴 312000)

痂状炭角菌Xylaria escharoidea(Berk.) Sacc.在分类学上隶属于子囊菌门Ascomycota炭角菌目Xylariales炭角菌科Xylariaceae炭角菌属Xylaria。炭角菌属是炭角菌科中最大的一个属，是该科的模式属，也是最早被描述的属[1-2]。据Daranagama等[3]估计，炭角菌属的种类超过500种。全世界共发现300多个炭角菌属物种，我国已知的炭角菌属真菌有61种[2]。炭角菌属真菌广泛分布于世界各地，特别是热带、亚热带和温带地区，在我国海南、贵州、广西、四川、浙江等地均发现多种炭角菌属真菌[4-5]。

炭角菌属是药食同源的兼用真菌，该属很多真菌种类都具有一定的药用价值[5-7]，比如增强机体免疫力、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、延长寿命等功效[8]；而且生物活性高、成分多样，越来越受到人们的青睐[9]。由于炭角菌生长环境特殊、对生长条件要求较高、自然资源稀缺，在世界药用真菌研究、应用领域均被视为珍稀资源，是一类亟待开发的新真菌资源。

鉴于炭角菌珍贵的药用价值和较高的经济价值，人们对炭角菌进行了大量探索和研究。近年来国内外关于炭角菌属的研究主要集中在培养条件优化、化学成分分析、药理作用和安全性评估等方面[8,10-13]。本研究在浙江省诸暨市大唐镇杨板桥山塘的白蚁死亡巢穴上采集到一个野生的大型炭角菌标本，经形态学和分子系统鉴定，为痂状炭角菌。国内外对痂状炭角菌的研究报道较少，邵雪莲[13]对液体培养及粗多糖提取条件、体外抗氧化活性进行了研究；闻绍峰等[14]以菌丝体生长状况为指标，对母种培养基及栽培菌核培养料进行了优化；Yue等[15]发现痂状炭角菌胞内多糖和胞外多糖具有抗氧化活性；Nagam等[16]从痂状炭角菌中鉴定出具有抗菌活性的化合物4,8-dihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)。目前有关痂状炭角菌人工培养子座的报道较少。本研究将采集的痂状炭角菌菌株分离后进行了形态和分子鉴定，对液体发酵条件和固体培养条件进行优化，对痂状炭角菌液体发酵产物的抗菌、抗氧化活性进行了测定，以期为今后痂状炭角菌的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

野生痂状炭角菌菌株(编号：ZJ1811，采集人：毛伟光)采集于浙江省诸暨市大唐镇杨板桥山塘白蚁死亡巢穴上，经鉴定，该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏号为CGMCC NO.17000)。

1.2 培养基

PDA 培养基：马铃薯 200 g/L、葡萄糖 20 g/L、琼脂 15 g/L、氯霉素 0.1 g/L，pH 自然；液体发酵基础培养基：马铃薯 200 g/L、葡萄糖 20 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO41 g/L，pH 自然；木屑基础培养基：木屑、石膏、蔗糖和玉米粉质量分数分别为78%、1%、1%和20%，加入质量为固体基料质量80%的水，混合均匀，pH自然；优化的液体发酵培养基：马铃薯 200 g/L、可溶性淀粉 40 g/L、蚕蛹粉 6 g/L、MgSO40.6 g/L，pH 自然；LB 固体培养基：蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 自然。所有培养基均在120 ℃高温高压条件下灭菌40 min。

1.3 菌株的分离和培养

将采集的子座样品使用75%(φ)乙醇溶液表面灭菌20 s，然后用无菌水冲洗3次。在超净台上用灭菌的刀片切取小块(1 cm×1 cm)子实体接种于PDA 培养基，置于 (28±1) ℃ 培养箱培养 3 d。挑取单菌落进行分离、纯化，并重复纯化1次，获得纯化的菌株。

1.4 子座切片六胺银染色

子座组织石蜡切片染色由武汉赛维尔生物科技有限公司利用六胺银染色法进行，包括石蜡切片脱蜡脱水、六胺银染色、组织酸化、孵育染色、显色和脱水封片，最后在正置光学显微镜Eclipse E100(尼康，日本)下观察拍照。

1.5 ITS序列测定

根据真菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)操作说明提取野生子座及分离菌株培养的菌丝体的基因组DNA。以提取的基因组DNA作为模板进行ITS序列扩增。PCR反应体系(20 μL)：Taq 聚合酶 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。扩增条件：94 ℃ 预变性3 min，94 ℃ 变性 30 s、55 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸1 min，30 个循环，72 ℃ 延伸 10 min。引物序列：ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和 ITS5 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR 扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后送至通用生物系统(安徽)有限公司测序。测序结果在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用Blast程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行相似性搜索比对。

1.6 液体培养条件优化

1.6.1 碳源、氮源和金属离子筛选 取 4 ℃ 保存的斜面菌种，室温复苏30 min后，接种到PDA培养基，(28±1)℃条件下培养至菌丝长满平板，得到活化菌种。将活化菌种分别接种(接种量为直径0.5 cm菌碟)至含不同碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉)、不同氮源(酵母粉、蛋白胨、蚕蛹粉、氯化铵、尿素)和不同金属离子(KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、CaCl2、MnSO4)的液体发酵基础培养基中，在温度 (28±1)℃、装液量 150 mL/250 mL 三角瓶、转速160 r/min的条件下培养8 d。将滤纸烘干至恒质量，称质量并记录；用烘干的滤纸过滤发酵液，将滤纸及过滤物烘干至恒质量，称质量，计算菌丝干质量。据此筛选最优三因素，试验重复3次。

1.6.2 三因素浓度筛选 在“1.6.1”优化确定最佳三因素(碳源、氮源及金属离子)基础上，设置单个因素的水平，筛选出每个因素最有利的3个水平。其中碳源(可溶性淀粉)质量分数为1%、2%、3%、4%、5%，氮源(蚕蛹粉)质量分数为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2% 和金属离子(MgSO4)质量分数为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%。按照“1.6.1”培养条件及计质量方法进行液体发酵及水平筛选，试验重复3次。

1.6.3 正交试验 以筛选出的最佳三因素的3个水平，即可溶性淀粉质量分数为3%、4%和5%，蚕蛹粉质量分数为0.2%、0.4%和0.6%，MgSO4质量分数为0.04%、0.06%和0.08%，构建三因素三水平表，并按照正交试验方案表进行正交试验。按照“1.6.1”培养条件及计质量方法进行发酵培养及条件优化，试验重复3次。

1.7 固体培养条件优化

在木屑基础培养基中添加基料质量1%的不同的氨基酸(缬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)。将50 g培养基装入透明培养瓶(直径80 mm、高120 mm)中，用玻璃棒在培养基上打孔，灭菌、冷却后备用。每瓶接种1 mL液体发酵3 d的菌液，在(28±1)℃条件下培养15 d。木屑基础培养基为空白对照，统计子实体数量、粗细及高度。

1.8 液体发酵产物的制备

选用优化的液体发酵培养基进行痂状炭角菌菌株的液体发酵。接种量为直径0.5 cm打孔器菌碟 1 块，按照温度 (28±1)℃、装液量 150 mL/250 mL、转速160 r/min的培养条件培养8 d。收集发酵液，经100目孔径双层纱布过滤除菌丝后，在4 ℃、12 000 r/min 条件下离心 30 min 除去发酵液中较大颗粒物质。收集上清液，于64 ℃条件下旋转蒸干备用。

1.9 抗菌活性测定

利用平板打孔抑菌法进行抗菌活性测定。将LB固体培养基融化后，取20 mL冷却至45 ℃左右，加入30 μL革兰阴性菌-大肠埃希菌Escherichia coli或革兰阳性菌-金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(D600nm=0.3)，摇匀，倒入一次性培养皿。待培养基凝固后，平板上打孔(直径7 mm)，每孔加入液体发酵产物 100 μL(质量浓度为10 mg/mL)，以同体积水和山梨酸钾溶液(质量浓度为 10 mg/mL)分别作为阴性和阳性对照，(37±1)℃条件下培养过夜，观察并测量抑菌圈直径。

1.10 抗氧化活性测定

将液体发酵产物用乙醇重溶(质量浓度为1.0 mg/mL)，以维生素 E(VE)和维生素 C(Vc)作为阳性对照，不加样品作为空白对照(CK)。用乙醇将1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)配成浓度为0.5 mmol/L 的溶液。依次加入 0.1 mL 样品、1.0 mL DPPH、1.9 mL 乙醇和 2 mL 0.1 mol/L 醋酸盐缓冲液后混匀，25 ℃条件下避光反应30 min，然后利用分光光度计(SOPTOP)测定517 nm处光密度。试验重复3次，按照下式计算样品抗氧化活性：

式中， 为空白对照在517 nm处光密度，为样品在517 nm处光密度。D517 nm(空白)D517 nm (样品)

1.11 数据分析

使用数据处理系统DPS v7.05的单因素方差分析(ANOVA)进行数据统计分析。显著性差异分析采用 Duncan’s新复极差法 (P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 采集的炭角菌菌株子座形态特征

对从浙江省诸暨市白蚁死亡巢穴上生长的子座进行形态鉴定。该子座单生直立，子座大、圆柱型，质地坚硬，底部有柄，细小黑色，中上部分粗大，颜色为黄色至黑灰色，表面有黑色凸起，顶部呈细长状(图1A)。子囊壳多个、椭圆形，埋生于子座内侧(图1B)，孔口乳状凸起(图1C)。子囊圆柱形，具长柄(图1 D)，内含8个子囊孢子，单列排列，子囊孢子椭圆形，不等边，6.0～6.5 μm×2.0～2.5 μm，较光滑(图1E)。上述形态特征与痂状炭角菌[4]相符。

图1 采集的炭角菌子座外观形态及子囊横切面Fig.1 Appearance and ascus cross-section of collectedXylaria stromata

2.2 采集菌株ITS序列测序及鉴定

通过扩增和DNA测序，将子座ITS序列(Accession No.：MZ326827)和分离培养菌丝体ITS 序列 (Accession No.：MZ326828)上传到NCBI的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。将测序结果在NCBI数据库利用网上在线Blast程序进行相似性比对。比对结果显示子座ITS序列及培养的菌丝体ITS序列完全一致，与痂状炭角菌 (Accession No.：MN622766)只有1个位点的核苷酸序列不同，相似性达到99%以上。经过形态鉴定和分子鉴定，将该子实体及其分离菌株最终命名为痂状炭角菌 ZJ1811。

2.3 痂状炭角菌液体发酵培养条件优化

在添加不同碳源试验中，痂状炭角菌对供试碳源有不同程度的利用率。添加葡萄糖、果糖、可溶性淀粉发酵的菌丝干质量较大，可溶性淀粉发酵的菌丝干质量达1.905 g(图2A)。在添加不同氮源试验中，添加蚕蛹粉发酵的菌丝与添加蛋白胨、酵母粉、氯化铵和尿素发酵的菌丝差异显著。蚕蛹粉是最佳氮源，菌丝干质量达3.083 g；而痂状炭角菌对氯化铵、尿素的吸收较差，不适于菌丝生长(图2B)。在添加不同无机金属盐离子试验中，添加MgSO4产生的菌丝干质量最大，达1.932 g(图2C)。综合菌丝产量及试验成本，筛选出适合痂状炭角菌菌丝体生长的最佳碳源、氮源、金属离子分别为可溶性淀粉、蚕蛹粉、MgSO4。

图2 添加不同碳源、氮源、金属离子的菌丝体干质量Fig.2 Dry weight of mycelia with different carbon and nitrogen sources,and metal ions

液体发酵最佳三因素三水平筛选结果如图3所示，不同处理间的菌丝体干质量差异显著。同时可以看到，随着可溶性淀粉、蚕蛹粉和MgSO4的添加量增加，菌丝体产量也在增加，但是达到最大量之后，菌丝体产量就会随着添加量的增加而减少。这也说明，菌丝体发酵的碳源、氮源和金属离子不是越多越好，添加多了反而抑制菌丝生长。筛选菌丝体干质量最大的3个添加量分别是可溶性淀粉质量分数3%、4%、5%；蚕蛹粉质量分数0.2%、0.4%、0.6%；MgSO4质量分数 0.04%、0.06%、0.08%。

图3 添加不同质量分数可溶性淀粉、蚕蛹粉和MgSO4的菌丝体干质量变化Fig.3 Dry weight of mycelia with different mass fractions of soluble starch,silkworm pupa powder and MgSO4

通过上述结果确定痂状炭角菌培养条件最佳三因素三水平，按照正交试验表进行正交优化试验。从表1可以看出痂状炭角菌发酵菌丝干质量最大为3.335 g，而从K值可以看出，痂状炭角菌各因素最大菌丝干质量水平为可溶性淀粉4%、蚕蛹粉0.6%、MgSO40.06%；从极差R可以看出不同因素影响痂状炭角菌生长的顺序为可溶性淀粉＞蚕蛹粉＞MgSO4。综上所述痂状炭角菌菌株液体发酵培养各成分质量分数最佳为可溶性淀粉4%、蚕蛹粉0.6%、MgSO40.06%。

表1 痂状炭角菌液体培养优化正交试验结果Table 1 Results of Xylaria escharoidea liquid culture optimization using orthogonal experiment

2.4 添加不同氨基酸对无性子座生长的影响

痂状炭角菌在添加不同氨基酸的条件下培养15 d后可见无性子座(图4)，子座生长情况统计结果见表2。除了添加甲硫氨酸外，从无性子座数量、粗细 (粗：直径≥3 mm，细：直径＜3 mm)和长度 (较长：＞8 cm，长：5～8 cm，较短：2～5 cm，短：＜2 cm)来看，添加氨基酸培养的无性子座生长都好于对照CK(未添加氨基酸)，说明添加氨基酸能够促进子座的生长。从子座数量来看，添加了苯丙氨酸、苏氨酸、组氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的培养基培养的子实体数量较多，显著高于CK；从子座粗细来看，添加了缬氨酸、精氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的培养基培养的子实体较粗；从子座长度来看，添加了缬氨酸、甘氨酸、苏氨酸和异亮氨酸培养基培养的子座长度较长。综合子座数量、粗细和长度，添加缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的固体培养基是比较好的固体培养基，能够有效促进子座的生长。

图4 不同培养天数的无性子座Fig.4 Asexual stromata cultured for different days

表2 添加不同氨基酸对无性子座生长的影响1)Table 2 Effects of different amino acid additions on the growth of asexual stromata

2.5 痂状炭角菌液体发酵产物抗菌活性

痂状炭角菌液体发酵产物大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌打孔法抑菌试验结果如图5所示，统计结果见表3。从表3可以看出，发酵产物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性要高于对大肠埃希菌的。另外在相同浓度下，发酵产物抗菌效果优于常用的化学抗菌剂山梨酸钾，说明痂状炭角菌株发酵产物具有优良的抗菌作用，将来可开发为食品等防腐保鲜的抗菌剂。

图5 平板抑菌法测定痂状炭角菌液体发酵产物抗菌活性Fig.5 Antibacterial activity of liquid fermentation product of Xylaria escharoidea by plate bacteriostatic method

表3 痂状炭角菌液体发酵产物对细菌的抗菌活性1)Table 3 Antibacterial activity of liquid fermentation product of Xylaria escharoidea against bacteria

2.6 痂状炭角菌液体发酵产物抗氧化活性

痂状炭角菌液体发酵产物对DPPH的抗氧化活性为(75.19±2.08)% (图6)，显著高于阳性对照维生素E的抗氧化活性(60.56±1.21)%，但显著低于维生素C的抗氧化活性(79.07±1.65)%，说明痂状炭角菌液体发酵产物具有一定的抗氧化效果。

图6 痂状炭角菌液体发酵产物的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of liquid fermentation product of Xylaria escharoidea

3 讨论与结论

炭角菌属某些真菌具有多种应用价值，但它们的天然资源非常稀少，而且生长周期长，不能满足需求。利用现代生物技术进行液体深层发酵和固体培养，可以获得用于研发或应用的菌丝体、代谢产物及子座[17]。经形态观察、ITS序列测定及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定，将从浙江省诸暨市白蚁死亡巢穴上采集的子座鉴定为痂状炭角菌。痂状炭角菌国内外报道较少，目前邵雪莲[13]、闻绍峰等[14]的报道均为子座的人工栽培技术研究。本研究以菌丝体干质量为指标，通过单因素试验对不同碳源、氮源和金属离子进行筛选；结果显示痂状炭角菌菌丝体发酵最佳碳源为可溶性淀粉，最佳氮源为蚕蛹粉，最佳无机金属盐离子为MgSO4。痂状炭角菌的菌丝体在不同碳源的培养基下均能生长，但它们之间存在显著差异，在可溶性淀粉培养基上发酵的菌丝干质量最大，这与邵雪莲等[13]研究痂状炭角菌液体发酵试验结果一致。在添加不同氮源试验中，痂状炭角菌对供试氮源有不同程度的利用率，不同氮源菌丝体干质量排序为蚕蛹粉＞蛋白胨＞酵母粉＞氯化铵＞尿素。天然氮源(蚕蛹粉)最适合痂状炭角菌菌丝生长，其次是有机氮源(蛋白胨和酵母粉)，无机氮源(氯化铵和尿素)效果较差。闻绍锋等[14,18]也发现不同氮源炭角菌菌丝生长效果不一致，天然氮源优于有机氮源，有机氮源优于无机氮源，无机氮源中的铵态氮优于硝态氮，铵态氮中的磷酸二氢铵优于其他铵盐。大型真菌生长需要的矿物元素分为大量元素和微量元素，大量元素有P、S、Mg、K和Ca，微量元素有 Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo 等[19]。从本研究结果可知痂状炭角菌菌丝对无机盐的利用存在差异，菌丝体干质量排序为 MgSO4＞KH2PO4＞CaCl2＞MnSO4＞ZnSO4，添加MgSO4的培养基菌丝生物量最大，前四者没有显著差异，表明Mg、K、Ca和Mn是痂状炭角菌生长必需的大量元素和微量元素。邵雪莲[13]也发现添加KH2PO4和MgSO4的培养基中痂状炭角菌菌丝生物量最大，而陈宛如等[20]研究发现Mg2+、Zn2+是黑柄炭角菌的生长必需元素；这表明不同炭角菌种类对无机盐的利用率有所不同。经正交试验筛选的液体发酵培养基成分最佳质量分数为可溶性淀粉4%、蚕蛹粉0.6%、MgSO40.06%。

氨基酸是构成生物体蛋白质最基本的物质和营养成分之一。我们在木屑基础培养基中添加不同的氨基酸，发现除了添加甲硫氨酸外，添加氨基酸培养的无性子座生长(数量、粗细和长度)均优于未添加氨基酸的培养基。张文强等[21]研究蛋白添加剂对双孢菇农艺性状及品质的影响，发现豆粕、膨化大豆、玉米等蛋白均能有效提高蘑菇产量及蘑菇子实体蛋白质含量。马元伟等[22]也发现通过氨基酸的添加，丝状真菌菌株产孢能力增加，可以实现简单经济地防止丝状真菌退化。

炭角菌属真菌大多数具抗氧化、抗菌、清除自由基、抗机体衰老等功能。龚庆芳等[23]对黑柄炭角菌发酵菌丝的化合物进行提取，发现1-(2,6-二羟基苯)-3-羟基-丁酮具有很强的抗氧化活性。翁榕安等[24]报道水溶性黑柄炭角菌肽对DPPH自由基的清除能力与维生素C接近。刘霞[25]从纵条纹炭角菌次生代谢产物中分离出2个抗菌活性强的化合物-麦角甾醇和过氧麦角甾醇，对多种病菌都表现出较强的抑制活性。本研究也发现痂状炭角菌液体发酵产物具有较强的抗菌和抗氧化活性，因此，需要对痂状炭角菌液体发酵液的次生代谢产物进行深入的研究，为今后将痂状炭角菌液体发酵产物开发为抗菌剂、抗氧化剂等提供科学依据。