基于网络药理学探讨穿山龙-威灵仙药对治疗痛性糖尿病周围神经病变的分子机制
2022-01-26孔琬琳冷锦红
孔琬琳，冷锦红
（1.辽宁中医药大学 研究生学院，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院 内分泌科，辽宁 沈阳 110032）
痛性糖尿病周围神经病变（Painful diabetic peripheral neuropathy, PDPN）是糖尿病治疗中最具挑战性的并发症之一[1]。临床表现主要以疼痛为主，或伴有四肢麻木、灼热、冰凉等感觉异常。严重影响患者的生活质量，给患者造成极大痛苦。现代医学研究多在控制血糖的基础上，给予抗氧化剂、醛糖还原酶抑制剂、营养神经、改善微循环、镇痛药物等对症治疗[2]，虽取得一定疗效，但仍未从根本上解决问题。
中医学将PDPN 归属于“消渴痹症”。穿山龙和威灵仙是治疗各种顽痹的要药。威灵仙辛散温通，性猛善走，可宣通十二经络；穿山龙药性刚性纯厚、力专功捷，有补虚之功。两药共用，能走能守，能通能补，相辅相成，共奏补虚通络，活血定痛之功。两药经过配伍之后，寒痹、热痹、湿痹、虚痹均可用之，故为诸多医家所喜，是临床治疗痹症的经典对药[3-5]。本研究主要通过网络药理学探讨穿山龙-威灵仙药对治疗PDPN 的分子作用机制，并运用分子对接进行验证，为进一步研究其治疗PDPN作用提供了基础。
1 资料和方法
1.1 活性成分筛选
运用TCMSP 数据库，检索“穿山龙”“威灵仙”活性成分，并以“OB ≥30%”和“DL ≥0.18”为限制条件，将结果输入Excel表格以获得活性成分数据集。
1.2 靶点预测与筛选
运用PharmMapper、UniProt 数据库进行检索，得到药对靶点和对应基因。运用Genecards 数据库筛选得到与PDPN 相关的基因。两者取交集，最终得到穿山龙-威灵仙药对治疗PDPN 的潜在靶点。输入Excel 表格以获得靶点数据集。
1.3 生物信息学GO 分析和信号通路KEGG 分析
运用DAVID 6.8 数据库进行GO 分析和KEGG分析，得到相应通路。运用CTD 数据库，以 “painful diabetic peripheral neuropathy”“diabetic neuropathy”为关键词进行检索，得到PDPN 的相关信号通路。将其与之前检索到的通路相匹配，作为穿山龙-威灵仙药对治疗PDPN 的信号通路。将其输入Excel 表格，以获得信号通路数据集。
1.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建
将靶点输入String 11.0 数据库，构建网络图。设置参数＞0.90，以保证相互作用关系的高置信度。将其导入Cytoscape 3.7.2 软件构建PPI 网络图。
1.5 “成分-靶点-通路”网络构建
运用上述结果筛选出核心成分、靶点、信号通路，并将其导入Cytoscape3.7.2 软件，构建“成分-靶点-通路”网络图。研究穿山龙-威灵仙药对治疗PDPN 的机制。
1.6 分子对接
从蛋白晶体结构数据库（http://www.rcsb.org）中下载核心靶点，保存为PDB 格式。从TCMSP 数据库中下载核心有效成分，保存为.mol 格式。运用PyMOL 和AutodockTool 1.5.6 软件进行分子对接。
2 结果
2.1 活性成分筛选
运用TCMSP 数据库检索出66 个活性成分。其中，穿山龙有9 个、威灵仙有57 个。限定条件为“OB ≥30%”“DL ≥0.18”，最终得到活性成11 个，其中，穿山龙有3 个（即D9-D11）、威灵仙有8 个（即D1-D8）。各活性成分具体信息如表1 所示。
2.2 靶点预测
运用PharmMapper、UniProt 数据库获取靶蛋白。去掉各活性成分重复靶蛋白，得到靶蛋白197 个。将其与从Genecards 数据库中检索到的目标蛋白相匹配。剔除假阳性靶蛋白后，得到129 个潜在靶蛋白，见图1。在穿山龙中，活性成分薯蓣皂甙元棕榈酸酯（diosgenin palmitate）对应的靶蛋白数目最多，有68 个。在威灵仙中，β-谷甾醇（beta-sitosterol）对应的靶蛋白数目最多，有72 个。表明薯蓣皂甙元棕榈酸酯和β-谷甾醇可能是穿山龙-威灵仙药对治疗PDPN 的核心有效成分，具体信息见表1。
表1 穿山龙-威灵仙药对活性成分基本信息Tab.1 Basic information on active ingredients of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma drugs
图1 穿山龙-威灵仙药对基因与PDPN 基因韦恩图Fig.1 Venn diagram of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma gene and PDPN gene
2.3 生物信息学 GO 分析和信号通路 KEGG 分析
运用DAVID 6.8 数据库进行GO 分析和KEGG分析，得到BP 126 个、CC 24 个、MF 38 个、KEGG通路88 个。限定P＜ 0.01，得到BP 43 个、CC 13 个、MF 13 个、KEGG 通路48 个。将这些通路与CTD 数据库中检索到的通路进行匹配，最终得到34 条通路。
GO 分析结果按靶点数目排序，取前10 位绘制成图表。见图2-图4。结果显示，在生物过程方面，主要涉及DNA 转录、蛋白水解、氧化还原、RNA聚合酶负调控、血管生成和负调节凋亡等。在细胞组成方面，主要涉及细胞外基质、细胞核、细胞质和线粒体等。在分子功能方面，主要涉及ATP 结合、锌离子结合和类固醇激素受体活性等。
图2 穿山龙-威灵仙药对主要活性成分的BP 富集分析Fig. 2 BP enrichment analysis of the main active components of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma drugs
图3 穿山龙-威灵仙药对主要活性成分的CC 富集分析Fig. 3 CC enrichment analysis of the main active components of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma drugs
图4 穿山龙-威灵仙药对主要活性成分的MF 富集分析Fig. 4 MF enrichment analysis of the main active components of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma drugs
KEGG 分析结果按靶点数目排序，选取前20 位绘制成图表，见图5。结果显示，大多数基因主要富集到Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、PI3K-Akt 通路、Ras 通路、Focal adhesion、Rap1 通路、MAPK 这几条通路。Pathways in cancer 富集基因最多，有23 个。其余分别为19、16、15、13 个。表明Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、PI3KAkt 等前20 位通路可能是穿山龙-威灵仙药对治疗PDPN 的关键通路。
图5 穿山龙-威灵仙药对KEGG 通路富集分析高级气泡图Fig. 5 Advanced bubble diagram for KEGG pathway enrichment analysis by Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma drugs
2.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建与分析
运用String 11.0 数据库构建网络图，并将置信度限制设置为大于0.90。将其导入Cytoscape 3.7.2 软件中。以degree 值≥12（中位数值），BC ≥0.001 286 55（中位数值）和CC ≥0.420 924 57（中位数值）进行筛选，得到核心靶点5 个，相互作用关系见图6、表2 。这些 degree 较高的靶点是PPI 网络关系的枢纽，可能在穿山龙-威灵仙药对治疗PDPN 的过程中起到了关键作用。
图6 蛋白相互作用（PPI）网络图Fig. 6 Network diagram of protein interactions (PPI)
表2 蛋白相互作用（PPI）网络中核心靶点拓扑学性质Tab. 2 Topological properties of core targets in protein interaction (PPI)networks
2.5 成分-靶点-通路网络构建与分析
将穿山龙-威灵仙药对、2 个核心成分、7 个核心靶点和20 个关键通路输入 Cytoscape 3.7.2 软件，构建网络图。共有31 个节点，78 条边，结果见图7。由此可见，穿山龙-威灵仙药对中多种活性成分、多种通路与多种靶点，相互影响、共同参与，起到对PDPN 的治疗效用。
图7 “化合物-靶点-信号”通路网络图Fig. 7 Network diagram of “compound-target-signaling” pathway
2.6 分子对接验证
将核心成分分别与核心靶点进行分子对接，结果见表3。一般认为，分子对接结合能越低，结构越稳定，结合作用越好。若结合能低于或等于-5 Kcal/mol，则认为该活性成分与靶蛋白结合作用较好[6]。结果显示，各配体与受体结合能均小于-5 Kcal/mol，结合作用较好，表明本研究对核心成分和核心靶点的预测具有一定科学性。其中，薯蓣皂甙元棕榈酸酯与PTPN11 的结合能最低，为-9.0 Kcal/mol，结构最稳定。除此以外，β-谷甾醇与EGFR、MAPK8，薯蓣皂甙元棕榈酸酯与EGFR、β-谷甾醇与MAPK1 的结合作用也较好，结合能分别为-8.6 Kcal/mol、-8.3 Kcal/mol、-8.1 Kcal/mol、-8.0 Kcal/mol。对接模式见图8。
表3 分子对接结果Tab. 3 Molecular docking results
结合模式分析可见，薯蓣皂甙元棕榈酸酯和PTPN11 结合嵌入疏水loop 区（PRO-38、THR-356、PHE-420、TRP-423、VAL-428、PRO-429、PRO-432、VAL-435、PHE-438、THR-468、PHE-469、GLU-508、ALA-509、ALA-517）。β－谷甾醇和MAPK8 氨基酸残基 ASP-112 形成 1 个氢键，并嵌入疏水 loop 区（ILE-32、GLN-37、VAL-40、VAL-158、LEU-168）。薯 蓣 皂甙元棕榈酸酯与 EGFR 结合嵌入疏水 loop 区（PHE-699、VAL-702、ALA-719、LYS-721、THR-766、ARG-817、LEU-820、LEU-834）。β－谷甾醇与MAPK1 结合嵌入疏水loop 区（ILE-31、TYR-36、VAL-39、LYS-54、LEU-156）。
3 讨论
本研究筛选出靶点197 个，与PDPN 有关的靶点129 个，占总靶点的66%，说明穿山龙-威灵仙药对对于PDPN 的治疗具有极高的针对性。研究表明，Src激酶能够介导NMDA 受体磷酸化，调控受体与胰岛素结合，从而调节血糖[11]。MAPK1 和MAPK8 是JNK家族的一员，对细胞应激具有重要作用。它与血糖调控、氧化应激和生长因子活化等有关，对PDPN 的形成有一定影响[12-14]。HSP90AA1 和EGFR 皆与细胞凋亡有关，能够有效抑制异常细胞周期进程，显著降低细胞活力，对胰岛细胞具有调控作用，在胰岛素抵抗、T2DM 等代谢紊乱方面具有良好效用[15]。ESR1 可以影响激素分泌的水平，进一步影响血糖的变化，对于糖尿病及其合并症皆具有重要影响[16]。这些核心靶点在PDPN 的治疗中都占据着关键位点、发挥重要作用。
KEGG 富集涉及PI3K-Akt、MAPK 等34 个信号通路。研究表明，激活PI3K-Akt 通路不仅可以引起炎症因子过度表达，还可以激活免疫反应，使病变持续加重，并引起神经功能的改变，出现疼痛等症状，是PDPN 发生的重要机制[17]。在高血糖状态下，AGEs 与受体发生反应，通过Ras 通路，能够引起微循环障碍，引发PDPN[18]。Focal adhesion通路激活可抑制部分 DNA 甲基转移酶诱导 DNA 低甲基化[19]。Rap1 和MAPK 通路在糖尿病的发病和治疗中具有重要意义[20-21]。MAPK 通路是目前为止关于糖尿病及其并发症研究最深入的通路之一，是穿山龙治疗PDPN 的核心通路之一[22]。激活该通路，可引起炎症反应，调控神经细胞凋亡，与“疼痛”形成相关，在PDPN 的治疗中具有重要意义[23]。
4 结论
穿山龙-威灵仙药对可能主要通过薯蓣皂甙元棕榈酸酯和β -谷甾醇等核心成分，分别与MAPK1、MAPK8 等核心靶点以氢键、疏水作用等方式结合，作用于PI3K-Akt、MAPK 等关键通路，起到治疗PDPN 的作用。研究证明了穿山龙-威灵仙药对治疗PDPN 多成分、多靶点、多途径的作用机制。分子对接结果验证了核心成分与核心靶点结果的可靠性、科学性。但本研究作为作用机制探讨尚停留在计算机模拟的理论研究层面，后续还需进一步的临床和实验研究验证其药效及作用机制。
