艾灸胃经穴调控EGFR 信号通路对胃癌细胞生长的抑制作用及其机制研究*

聂瑞华 龚 安

（江西中医药大学岐黄国医书院，江西 南昌 330025）

胃癌是我国发病率、致死率较高的恶性肿瘤之一，由于胃癌病因尚未完全清楚，实施针对病因的一级预防非常困难，因此有效防治胃癌前病变，阻断其向胃癌发展，已经成为预防胃癌、减少其发病率的重要途径[1]。现代医学对胃癌的防治效果尚不理想，但中医药防治胃癌具有疗效较好、不良反应少等特点，中医药对慢性萎缩性胃炎癌前病变具有较好的临床疗效。并且经临床研究证实，艾灸对胃癌等恶性肿瘤性疾病有很好的防治作用[2]。恶性肿瘤作为机体在多种复杂不良因素作用下，引起细胞信号传导紊乱导致相关基因表达失调而发生的分子疾病，现研究发现，其信号传导系统的缺陷和异常活化与肿瘤发生、发展及预后的关系已成为肿瘤分子生物学的研究热点，同时通过干预信号传导途径治疗肿瘤也成为生物治疗的新兴领域[3，4]。EGFR 信号通路是关键的细胞增殖和凋亡相关信号通道之一，该通路的调控紊乱与胃癌等许多恶性肿瘤的发生、发展密切相关，因此干预该信号通路已成为肿瘤靶向治疗的热点[5]。对此本研究选取纯系合格SD 大鼠100 只进行研究，通过探讨艾灸胃经穴抑制胃癌细胞生长的信号转导机制，揭示艾灸胃经穴抑制胃癌细胞生长的调节位点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组研究选取纯系合格SD 大鼠100 只，雄性，SPF 级，4 周龄，大鼠群养于垫锯木屑的饲料笼中，每笼5 只，控制室温22 ℃，相对湿度50%，采用自然光暗周期，自由饮水，检疫3 周后分组实验。按随机数字表法随机分为5组，即正常组、艾灸胃经穴组、艾灸对照点组、艾灸胃经穴+PD153053组和艾灸对照点+PD153053组，每组20 只。正常饲养1 周后，艾灸胃经穴组、艾灸对照点组第2 日起即给予相应处理，至第20 周结束；模型组造模后不予任何治疗；正常组不作任何处理，采用同等条件饲养，第20 周后处死所有大鼠。

1.2 实验仪器与试剂CW0889 哺乳动物细胞抽提试剂盒.康为世纪CW2333SRIPA Lysis Buffer（Str ong）（康为世 纪），CW0049ECL 高灵敏度化 学发光检测试剂盒康为世纪，CW0048ECL 低背景学发光检测试剂盒（康为世纪），CW02029 一步法快速WB（HRP）试剂盒（兔）（康为世纪），CW02030 一步法快速WB（HRP）试剂盒（鼠）康为世纪，CW0056 蛋白印迹膜再生液（康为世纪），ZS-2 板式酶标仪天津泰斯特202-2AB 电热恒温箱湘仪（贝克），TGL-20M 台式高速冷冻离心机（EREE），Jan-78 磁力搅拌器（江苏其林贝尔），XW-80A 涡旋混合器（浙江巩义），800台式低速离心机（贵阳学通），PHS-802 中文台式酸度计图像分析软件（光密度值读取）：Gel-Pro analyzer 4。

1.3 实验方法

1.3.1 选穴与取穴选取大鼠足阳明胃经梁门、足三里穴为治疗穴位，对照点为梁门、足三里穴外1 cm，其中足三里位于膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm 处；梁门位于腹正中线与乳头线之间的中点，脐上4 寸。研究开始时将左右腓骨小头前下方和剑突下方两侧的体毛除去，确定穴位后用苦味酸作标记，备用。

1.3.2 艾灸方法将大鼠捆缚于鼠板，正常组、胃经对照组和药物对照组大鼠每天捆绑30 min；艾灸胃经穴组和艾灸对照点组大鼠，定位剪毛，将艾条固定于自制艾灸支架上，使艾灸穴位孔（直径2～3 mm）垂直距离大鼠胃经梁门、足三里穴位或非穴对照点0.5 cm，点燃施灸，每日1 次，每次30 min，持续1周，每次取单侧，两侧交替使用。

1.3.3 标本采集所有动物实验结束后，称取大鼠体质量，禁食不禁水24h，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剖腹、切开胃，取1/3腺胃部钝性分离胃黏膜组织，给予标号。（1）艾灸血清的制备：于末次艾灸后1～2h内于大鼠腹主动脉取血，低温4℃离心（3000r/min，5min），取上层血清，分装，保存于-80℃冰箱，作用于细胞培养体系前置于56℃水浴中30min灭活。（2）肿瘤细胞培养及孵育：①将人胃腺癌细胞株SGC7901培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（含青霉素100U/mL，含链霉素100U/mL）中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内常规传代培养。倒置相差显微镜下观察细胞呈贴壁生长，形态良好无退化，待其铺满瓶壁70%～80%时，以0.25%胰蛋白酶消化传代，每2～3d传代1次，隔日换液。取对数生长期细胞，弃原培养液，加PBS液冲洗2次，再用0.25%胰蛋白酶消化，机械吹打制成单细胞悬液，以1000r/min离心5min，弃上清液，加入适量的RPMI-1640培养基调整适宜的细胞浓度。②取对数期生长的胃癌细胞株，用0.25%胰蛋白酶消化，计数，以每孔100μL接种于96孔板中，使待测细胞密度1×104个细胞/孔，5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（约24h）后，EGFR阻断组加入10μmol/LPD153035在37℃下共同孵育30min，然后加入5%、10%、20%浓度梯度的艾灸血清培养液（艾灸组）或1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL浓度梯度的艾灸对照点组，每孔100μL，每浓度设5个复孔，5%CO2，37℃继续孵育48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），继续培养放入CO2培养箱4h。终止培养，小心吸取孔内培养液。每孔加入150 μL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，然后进行相关指标检测。

1.4 观察指标观察大鼠胃癌细胞EGFR 基因的表达，并利用Western blot 法检测胃癌细胞经EGFR 阻断前后p ERK 的表达，采用RT-PCR 法检测胃癌细胞经EGFR 阻断前后c-myc 基因的表达[6]。

1.5 统计学方法采用SPSS 23.0 统计软件对所得数据进行分析处理，计量资料用（）表示，t 检验，多组间比较行方差分析，多组间两两比较用SNK-q 检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠胃癌细胞EGFR基因的表达 5组大鼠癌细胞EGFR 基因表达差异均存在统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 大鼠胃癌细胞EGFR 基因的表达 （）

表1 大鼠胃癌细胞EGFR 基因的表达 （）

2.2 大鼠胃癌细胞EGFR阻断前后p ERK 的Western blot 检测结果 5组大鼠胃癌细胞EGFR 阻断前后p ERK 的Western blot 检测结果对比差异均存在统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 大鼠胃癌细胞EGFR 阻断前后p ERK 的Western blot 检测结果 （）

表2 大鼠胃癌细胞EGFR 阻断前后p ERK 的Western blot 检测结果 （）

2.3 大鼠胃癌细胞EGFR阻断前后c-myc 基因的表达 5组大鼠胃癌细胞EGFR 阻断前后c-myc 基因的表达差异对比存在统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 大鼠胃癌细胞EGFR 阻断前后c-myc 基因的表达（）

表3 大鼠胃癌细胞EGFR 阻断前后c-myc 基因的表达（）

3 讨论

经研究表明[7]，胃癌的形成并不只是由正常细胞向癌细胞演变的过程，它同时还是一个涉及多基因、多步骤的渐进过程，其中物理化学因素、感染因素、遗传因素等均可诱发该疾病，而且物理化学因素是慢性萎缩性胃炎癌前病变的主要原因。目前，临床对于该疾病的治疗以抑制或中和胃酸的药物、根除幽门螺杆菌的药物和保护胃黏膜的药物为主，必要时可长期补充抗氧化维生素、叶酸和β 胡萝卜素来预防或阻断胃癌癌前病变的发生[8]。在中医的认知中，胃癌癌前病变多将其划分至“胃脘痛”和“嗳气”等范畴。早在《灵枢·经脉》就已有相关记载“足阳明之脉，是动则病，食则呕，胃脘痛”，故而普遍认为该疾病的发病基础与脾胃虚弱密切相关，而其主要病机为本虚标实、虚实夹杂[8]。有研究发现[9]，对于胃癌等恶性肿瘤采用中医艾灸疗法具有显著的防治效果，其中足阳明经是治疗胃腑病症的首选经脉，足三里既是胃经的合穴，又是胃的下合穴，对该穴位进行艾灸治疗可以有效地发挥调节脾胃，助理运化的作用。但其具体的作用机制如何，尚缺乏相关的研究。

在本研究中以100 只4 周龄清洁级SD 大鼠为实验对象，分为正常组、艾灸胃经穴组、艾灸对照点组、艾灸胃经穴+PD153053组和艾灸对照点+PD153053组，实验20 周后处死制备血清检测相关指标，以EGFR 信号通路为切入点进行研究，结果发现，5组在EGFR 基因表达、p ERK 的Western blot 检测结果 和c-myc 基因表达方面差异均存在统计学意义（P＜0.05）。究其原因可以发现，恶性肿瘤是机体在多种复杂不良因素作用下，引起细胞信号传导紊乱导致相关基因表达失调而发生的分子疾病，而EGFR 信号通路则是造成细胞增殖和凋亡相关信号通道之一，与疾病的发生和发展之间具有重要意义[10]。经研究发现[11]，EGFR 是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受体，其配体包括EGF、转化生长因子α（TGF-α）、肝素结合EGF 样生长因子等，通过介导多种途径的信号通路调控细胞的生长、分化、增殖、迁移和存活等。EGFR 普遍表达于上皮细胞，它的过度表达或突变常与胃癌等许多恶性肿瘤的发生密切相关。EGFR信号通路在正常组织中多呈关闭状态，而在肿瘤组织中被激活开放，其下游信号转导通路主要包括Ras/Raf/MEK/ERK 途径，JAK/STAT 途径和PI3K/Akt途径，其中Ras/Raf/MEK/ERK 途径与肿瘤增殖的关系最为密切。EGFR 激活后可相继活化Ras、Raf、MEK，然后特异性的激活其下游蛋白激酶ERKl/2，最后转入核内调节核内转录因子，如c-fos，N-κB 等，启动相关基因的转录，调控细胞增殖、凋亡等过程[12，13]。除此以外，还有研究发现，EGFR 的信号传导通路并不是独立存在的，各个通路之间存在交叉，使细胞的最终效应受到多种因素的综合调控[14]。另外，给予外源性EGF 或刺激内源性EGF 分泌的药物对实验动物的胃癌前病变有明显的病理逆转作用，且不增加癌基因如Cerb-B2 的表达。临床上促进EGF 内、外源性分泌的胃黏膜保护剂对胃癌前病变有逆转治疗作用[15]。

综上所述，艾灸胃经穴可以干预EGFR 信号通路对癌细胞的介导增长作用，并在PD153035 阻断后有效抑制癌细胞的增殖和迁移，从而控制病情的发展，发挥显著的治疗效果。