不同病理分期膀胱癌患者循环肿瘤细胞的表达

严勇 孙洵 马绍翔 郑昕 王亮 李勇 王珂

膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，具有治疗后复发率高、死亡率高的特点，其在我国泌尿系肿瘤中的发病率及死亡率均为首位，近年来其发病率和死亡率有所下降[1]。而造成膀胱癌患者死亡的主要原因是远处转移[2]。进入外周血并能存活的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)，其在一定条件下能在远处定植而形成远处器官转移灶，因此，CTC是肿瘤能进行血行转移的前提。早期检测外周血CTC对评估患者远处转移风险、疾病预后以及治疗手段的选择具有重要意义[3]。本研究联合运用多种标志物，优选了免疫芯片分选法，检测膀胱癌患者外周血中的CTC，并分析CTC的表达与不同病理分期膀胱癌患者的相关性，现报告如下。

对象与方法

一、临床资料

收集2019年9月至2021年3月在昆明市第一人民医院就诊的不同病理分期的膀胱癌患者20例，其中男14例，女6例；年龄46～90岁，平均年龄(65.4±7.4)岁，均为膀胱尿路上皮细胞癌。T1期2例，T2期9例，T3期6例(2例合并淋巴结转移)，T4期3例(均合并有淋巴结转移)；肿瘤直径≤3 cm者12例，直径>3 cm者8例；单发9例，多发11例；患者均无远处转移及其他恶性肿瘤，均未接受过放化疗。本研究通过了医院伦理委员会审批，所有患者或家属均签署了知情同意书。

二、治疗方案

所有膀胱癌患者均按照指南要求治疗，非肌层浸润患者采用经尿道膀胱肿瘤电切术，术后常规进行表柔比星灌注治疗，表柔比星溶于0.9%氯化钠溶液，浓度为 600 μg/ml，灌注后膀胱内维持45 min～1 h，方案为1次/周，灌注8周，之后 1 次/月，灌注8个月；肌层浸润患者采用根治性膀胱切除术+尿流改道/原位新膀胱+淋巴结清扫术。所有患者均于术前行CTC检测。

三、CTC的检测及阳性判定

采集不同病理分期膀胱癌患者外周静脉血10 ml，裂解红细胞后去上清液，重悬，微流体芯片中推入EDTA、PBS和小牛血清白蛋白。将血样推入另一螺旋微通道入口，加入一抗混合液(CK8/18/19，CD45)、二抗混合液(Alexa488及Alexa555)后，再加入核染试剂(DAPI)孵育，电子显微镜下观察捕获的细胞，CK、Alexa488(+)/CD45、Alexa555(-)判定为阳性并予以计数。

四、统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件对检测的数据进行分析，以频数表示计数资料，组间比较采用χ2检验或者Fisher确切概率法，多因素分析采用Logistic回归分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

20例患者中有11例检出CTC，阳性率为55%(11/20)，CTC的计数为1～33个，1个CTC的患者有3例，2～8个CTC的患者有5例，8个以上的有3例。单因素分析显示，CTC的阳性率在肌层浸润性膀胱癌患者中明显高于非肌层浸润性膀胱癌患者；在病理分级高级别的患者中较低级别的患者阳性率高；有淋巴结转移者较无淋巴结转移者阳性率高；多发肿瘤者较单发者阳性率高；肿瘤直径>3 cm者较直径≤3 cm者阳性率高。患者性别、年龄则与CTC的阳性率之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。多因素Logistic回归分析显示，肿瘤高T分期(OR：T22.21、T34.15、T46.46)、病理分级高级别(OR：1.72)、有淋巴结转移(OR：4.87)和肿瘤直径>3 cm(OR：6.84)是CTC阳性的危险因素，见表2。

表1 膀胱癌患者病理特征与CTC阳性率的关系

表2 多因素Logistic回归分析

讨 论

有研究表明膀胱肿瘤中非肌层浸润型占70%[4]，其治疗后复发率高达78%，进展风险为45%，保留膀胱治疗后的死亡率为16%～23%[5]；而肌层浸润型则占30%[4]，即使行根治性膀胱全切术，其术后5年局部复发率仍可达20%，其中约50%的患者会出现远处转移灶或最终死亡，其主要原因为50%的患者在确诊时、手术前已存在微转移灶[6]。但目前传统影像学检查并不能较早发现这些微小体积的转移灶，也没有一种公认的可应用于早期检测这些微转移灶的生物学标志物。因此，临床上需要一种能精确检测这些微转移灶的新方法，以期早期诊断并指导治疗，从而提高膀胱癌的临床疗效，减少肿瘤进展和降低复发率。

从1869年首次报道CTC存在于肿瘤患者的血液循环中，到现在CTC检测逐渐被重视并广泛采用，其检测创伤小、特异性及灵敏度高，在临床应用中发挥了一定作用。CTC被认为是肿瘤复发、转移过程中的最直接因素[7]，目前已有外周血CTC检测用于乳腺癌、肺癌、直肠癌、前列腺癌等肿瘤的诊断和预后判断的研究，并取得重大进展[8-10]。因此，美国食品药品管理局已允许CellSearch CTC检测系统运用于临床，以监测乳腺癌、前列腺癌、肺癌和直肠癌患者的预后[11]。而目前CTC检测在膀胱癌中应用的报道尚不多，关于非转移膀胱癌的大宗前瞻性研究表明，即使外周血中仅出现1个CTC，也标志着患者在肿瘤相关病死率、肿瘤复发及总生存率等方面预后较差[6]。另一项研究表明，每7.5 ml外周血中发现≥1个CTC的膀胱癌患者中87%的病例短期内出现首次复发，并伴有病情进展，而CTC阴性的患者则没有出现疾病进展[12]。Gazzaniga等[13]研究证实术前CTC阳性率与膀胱肿瘤T1分期之间存在相关性，且CTC阳性与非肌层浸润性膀胱癌复发时间有关联性。Anantharaman等[14]报道了肌层浸润性或转移性膀胱癌患者外周血中程序死亡配体基因-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)表达于 CTC，所有25例患者均检测出CTC和PD-L1，提示PD-L1在CTC中的表达情况将可能用于监测膀胱肿瘤的治疗效果和预后判断。有荟萃分析表明，外周血CTC的检出为膀胱肿瘤患者有无预后不良的独立预测指标，因而可应用于膀胱癌的诊断，而CTC的阳性率与膀胱肿瘤的病理分期、有无转移、组织学分期及淋巴结转移明显相关[3]。这些研究均提示CTC与膀胱癌的病理分期有一定的相关性，对患者的疗效评估、预后监测和个体化治疗均有较大意义。

本研究中，我们也得出了相似的结果，选用免疫芯片分选法检测具有不同病理特征的T1～T4期膀胱肿瘤患者外周血CTC，并分析其不同病理特征与CTC阳性率的相关性，结果提示CTC与肿瘤T分期、病理分级、淋巴结转移、肿瘤大小及数目有相关性(P<0.05)；多因素分析显示CTC与肿瘤T分期、病理分级、淋巴结转移及肿瘤大小有相关性(P<0.05)。故CTC的检测有利于在不同病理特征膀胱癌患者中早期明确易复发、转移者，从而准确地评估病情、调整治疗和判断预后。但同样也应认识到：肿瘤的转移其实是个低效过程，即使进入外周血的肿瘤细胞量大，真正能在远处定植成功的却极少。其主要原因是CTC没有了原位肿瘤的基质依托，面临着巨大生存压力，包括血流剪切力、氧化应激及免疫追杀等。因此，通过动态监测CTC，则有助于尽早判断复发及转移倾向、评判疗效，便于临床甄选合理、个体化的治疗方案，以期提高临床治疗效果。但由于目前的检测方法尚未完全统一，仍存在一定的假阴性或假阳性可能，且本研究也存在样本量小的不足，因此，未来研究应进一步建立统一标准化的检测质量控制体系，以确保所有研究结果评判标准的一致性；并早日进行大规模、多中心的临床研究，且可将CTC与其他生物标志物如循环肿瘤DNA联合检测,以进一步提升其早期判断预后、评估治疗效果和调整治疗策略的应用价值[15]。相信在不久的将来，CTC检测有望成为临床膀胱肿瘤诊断、早期预后评估、疗效评价及指导个体化治疗无创、便捷的重要监测手段，并在膀胱癌的综合诊疗体系中展现出较大的应用前景。