miR-155表达对人前列腺癌DU145细胞增殖及细胞周期的影响

张镜伟 马胜利 谢程国

前列腺癌的发病率在全球范围内不断上升，特别是在老年人群中，其发病率和死亡率均较高[1-2]。雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy, ADT)是目前前列腺癌治疗最有效的策略，尽管早期ADT有效率达90%以上[3-4]，但几乎所有患者在治疗2～3年后，均不可避免地出现对ADT耐药，晚期前列腺癌仍然是一种不治之症[5-8]。因此，需要进一步研究前列腺癌的发病机制，开发新的治疗手段。

微小RNA(miRNA)是一类通过与靶基因的3′非编码区(UTR)相结合，在转录水平调控靶基因水平的小RNA分子[9]。目前研究发现，miRNA可以作为细胞周期调控因子[10-11]，在肿瘤发生、发展中发挥着重要作用[12-15]。miRNA-155(miR-155)是一个受抑癌基因p53调节的小RNA分子，在多种肿瘤细胞中呈低表达[16-17]，且与肿瘤进展相关[18-19]。然而，有关miR-155在前列腺癌中的作用尚未有文献报道。因此，本研究旨在探讨miR-155在前列腺癌中的表达及其与患者预后之间的关系，揭示miR-155对前列腺癌细胞增殖能力的影响，为前列腺癌的靶向治疗提供潜在新靶点。

材料与方法

一、材料和试剂

收集我院临床前列腺癌和相应的癌旁组织标本(2019年1月至2020年1月)各30例，所有参与本研究的患者均给予知情同意，本研究得到广州市第一人民医院伦理委员会的批准。荧光定量PCR反转录和扩增试剂盒均购自Takara公司；MTS细胞增殖定量检测试剂盒购自美国Promega公司；主要使用的抗体包括 cyclin D1(ab16663)、cyclin E2(ab40890)、GAPDH (ab8245)购自美国Abcam公司；ECL荧光底物试剂盒购自美国 Pierce公司。miR-155抑制剂(miR212529133043-1-10)和相应的对照RNAs购自广州锐博公司。

二、细胞培养

人前列腺癌细胞株DU145和正常前列腺上皮细胞RWPE-1购自中国科学院干细胞库，RWPE-1细胞在角质细胞血清游离培养液(Gbico，Grand Island，NY)+1%青霉素和链霉素混合液中培养；DU145在含有10%胎牛血清(Gbico)+1%青霉素和链霉素组合的DMEM (Gbico)中培养。所有细胞在37 ℃标准细胞培养条件下(5% CO2，95%湿度)生长。

三、qRT-PCR检测

取对数生长期细胞，采用Trizol/氯仿/异丙醇法提取细胞总RNA，通过微量核酸蛋白定量仪(NanoDrop 2000)测定所提取RNA的浓度及纯度；然后，参照Takara公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit试剂盒说明书，将总RNA(1 μg)逆转录成cDNA；按照Takara公司的PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒说明书，以cDNA为模板进行PCR扩增，所需引物序列如表1所示。记录各组CT值并采用公式2-ΔΔCT对数据进行处理分析，得到各个细胞株中基因的相对表达量。

表1 荧光定量PCR所需的各基因引物序列

四、Western blot检测

收集对数生长期细胞，用预冷PBS洗涤细胞3次，然后加入细胞裂解缓冲液裂解细胞，经超声、离心后去掉其他细胞成分，使用微量核酸蛋白定量仪测定各蛋白样品的浓度及纯度；加入5×SDS上样缓冲液在沸水中煮沸10 min以使蛋白充分变性；配液10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，然后转膜、封闭，并在4 ℃条件下与一抗孵育过夜；二抗室温孵育2 h，采用化学发光法检测目的蛋白表达，并进行灰度值分析。

五、MTS细胞增殖实验

按照MTS细胞增殖定量检测试剂盒实验步骤，将100 μl完全培养液中的2 000个细胞接种到96孔板中，在37 ℃和5% CO2条件下培养1～5 d，然后每隔24 h在培养液中加入10 μl MTS，37 ℃条件下孵育4 h后，在490 nm波长处测定每孔吸光度值，根据结果绘制细胞生长曲线。

六、平板克隆形成实验

将细胞以每孔500个细胞的密度接种于6孔板中，培养7 d。用4%多聚甲醛溶液固定，0.1%结晶紫液染色，于倒置显微镜下计数细胞数在50个以上的克隆形成数目。

七、流式细胞术检测细胞周期

取对数生长期细胞，用 D-Hanks清洗3遍后加入不含胎牛血清的培养液静置过夜，然后用预冷PBS清洗3次，使用预冷75%乙醇固定细胞，放置于4 ℃冰箱内过夜；上机前离心去除乙醇，PBS洗涤3次后，加入100 μl RNase A，于37 ℃水浴条件下放置30 min；然后加400 μl的PI溶液，4 ℃避光染色1 h；在流式细胞仪上，根据测定DNA的含量确定细胞周期各期的百分比。

八、统计学方法

结 果

一、前列腺癌组织及细胞中miR-155的表达水平

采用qRT-PCR检测临床前列腺组织标本中miR-155的表达水平，如图1所示，miR-155在肿瘤组织中的表达水平(0.27±0.03)明显低于癌旁组织(1.02±0.05)，差异有统计学意义(P<0.01)；且与miR-155高表达组相比，miR-155低表达组患者的Gleason评分、临床分期更高，总体生存情况更差(P<0.05)，而年龄、PSA水平差异无统计学意义(P>0.05, 表2)。同样，我们也检测了miR-155在前列腺癌细胞中的表达水平，结果与临床标本相一致，miR-155在前列腺癌细胞DU145、PC-3、LNCaP、C4-2中的表达水平低于正常前列腺上皮细胞RWPE-1中的表达水平，且在DU145细胞中表达最低(图2，P<0.05)。

图1 miR-155在前列腺癌组织中的表达 (**P<0.01)

图2 miR-155在前列腺癌细胞中的表达

表2 miR-155表达与前列腺癌患者临床特征之间的关系(例)

二、miR-155过表达抑制前列腺癌细胞增殖能力

为了探讨miR-155在前列腺癌细胞中的生物学作用，我们通过转染miR-155 mimics或者加入miR-155抑制剂至DU145细胞培养液中，过表达/沉默miR-155表达。如图3所示，miR-155过表达后，DU145细胞的增殖速率明显减慢，平板克隆形成数目明显减少，结果具有统计学意义(P<0.05)；而加入miR-155抑制剂后，则结果相反(P<0.05)。

A：平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；B：MTS细胞增殖实验检测细胞增殖能力(*P<0.05)图3 miR-155抑制前列腺癌细胞增殖能力

三、miR-155过表达诱导细胞周期G1/S期阻滞

我们进一步探讨miR-155对细胞周期分布的影响及其机制。结果如图4A所示，相比miR-NC组细胞，miR-155 mimics组细胞G1期细胞百分比从(46.61±2.45)%增加到(71.92±3.68)%，而S期细胞百分比则由(38.77±4.12)%减少到(25.46±8.57)%，细胞周期G1/S期的进展表现出明显阻滞；而且miR-155过表达后，cyclin D1、cyclin E2蛋白表达水平降低，说明miR-155可能通过下调细胞周期素的表达抑制前列腺癌细胞的增殖(图4B)。

A：流式细胞术检测细胞周期分布情况；B：Western blot检测miR-155表达对cyclin D1、cyclin E2表达的影响图4 miR-155表达诱导前列腺癌细胞周期阻滞

四、miR-155通过靶向MYC抑制前列腺癌细胞增殖

为了探究miR-155下游的生物靶点，通过TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_80/)microRNA靶基因预测工具，我们发现原癌基因MYC是miR-155的潜在靶点(图5A)；且miR-155可以下调MYC表达水平(图5B)。挽救实验证明，MYC过表达后，可以逆转miR-155介导的前列腺癌细胞生长抑制，以及细胞周期素cyclin D1、cyclin E2的下调(图5C)，说明MYC 是miR-155的关键下游靶点。

讨 论

近年来，miRNA作为转录后调控网络中的重要调控因子，在肿瘤的发生、进展和转移中受到越来越多的关注。在许多类型的癌症(如肝癌、结肠癌)中，miR-155能促进肿瘤细胞增殖、迁移和分化，并抑制细胞凋亡[20-21]。然而，在某些类型的癌症(如胃癌)中，miR-155又起到相反的作用——如抑制胃癌细胞的生长[22]。因此，miR-155在不同类型的癌细胞中要么作为肿瘤致癌因子，要么作为肿瘤抑制因子。本研究中，我们发现miR-155在前列腺癌细胞中起肿瘤抑制作用。

A：miR-155与MYC 3′UTR结合位点示意图；B：Western blot检测miR-155表达对MYC表达的影响；C：MTS细胞增殖实验检测细胞增殖能力(*P<0.05)；D：Western blot检测cyclin D1、cyclin E2表达水平图5 miR-155通过靶向MYC抑制前列腺癌细胞增殖

有研究报道miR-155在前列腺癌中低表达[23]；然而，miR-155在前列腺癌中的作用尚未完全阐明。本研究发现miR-155在前列腺癌中抑制DU145细胞增殖，并诱导细胞周期阻滞。miR-155在结肠癌中抑制细胞的增殖、迁移和侵袭[24]，这与本研究结果一致。 细胞周期失控可导致细胞增殖异常，是肿瘤发生、发展的重要组成部分。细胞周期的过程受多个控制点的调控，其中G1/S和G2/M是最重要的调控点[25]。cyclin D1是调节G1/S检测点最关键的蛋白，它与cyclin D1-CDK4结合激活CDK4，导致RB蛋白高磷酸化而失活，进而引起转录因子E2F的释放，从而驱动细胞从G1期进入S期[26]。本研究发现过表达miR-155显著抑制了cyclin D1的表达，提示过表达miR-155可能通过G1/S限制点下调cyclin D1来抑制细胞增殖。对于其机制研究，我们发现miR-155通过碱基互补配对，靶向结合cyclin D1上游蛋白MYC，MYC通过上调cyclin D1和cyclin E2表达，驱动细胞周期进展，在肿瘤中发挥致癌作用。miR-155靶向沉默MYC基因，因此，在前列腺癌中诱导细胞周期G1/S阻滞，抑制前列腺癌细胞的增殖。

综上所述，miR-155在前列腺癌组织及细胞中呈低表达，miR-155过表达可能通过靶向沉默MYC，下调cyclin D1和cyclin E2的表达，从而诱导细胞周期G1/S期阻滞并抑制前列腺癌细胞增殖。因此，miR-155可能在前列腺癌发生、发展过程中发挥了重要作用。但是，本研究中仅采用了一个前列腺癌细胞系，也缺乏体内动物实验，miR-155 影响细胞周期蛋白的潜在机制尚有待进一步深入研究。