外周血循环肿瘤细胞的表型及TOP2A表达与膀胱癌复发转移及预后的关系

钟蛟 刘浩然 汪道琦 刘建和

膀胱癌是泌尿外科最常见的肿瘤之一，其远处转移是导致膀胱癌患者死亡的主要原因[1]。影像学技术难以发现早期微小转移灶，约50%的肌层浸润性膀胱癌(muscular invasive bladder cancer, MIBC)确诊时已有微转移灶[2]。外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)是指能逃避自身免疫监视进入外周血中的肿瘤细胞[3]。研究发现膀胱癌患者外周血中CTC的存在与疾病转归不良有关[3-4]。目前从单个CTC水平研究膀胱癌预后的文章较少，本文对45例膀胱癌患者的单个CTC上上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型和拓扑异构酶Ⅱα(topoisomerase-II alpha, TOP2A)表达进行检测分析，研究其对膀胱癌进展及预后的影响。

对象和方法

一、一般资料

收集从2013年9月至2016年8月在我院行根治性膀胱全切或经尿道膀胱电切术，且病理确诊为膀胱癌行CTC检测的45例患者。年龄35～84岁，平均60.93岁，男40例，女5例，肿瘤pTNM分期：T1期17例、T2期14例、T3期8例、T4期6例、N1期6例，肿瘤组织病理分级(根据WHO 2004年分级标准)：高级别31例、低级别14例。本研究经我院伦理审查委员会同意。

二、方法

采用CanPatrolTM二代多重RNA原位检测膀胱癌手术前外周血CTC计数、分型及TOP2A的表达。用8号采血针管和EDTA抗凝采血管采集2管(5 ml/管)外周血样本，转移至样本保存管中，进行预处理。经预处理后的样本抽滤至过滤器中，用特异捕获探针与目标mRNA进行杂交，扩增探针与捕获探针进行杂交，为杂交信号的扩大做准备。用标记有荧光基因的标记探针与扩增探针进行杂交，产生荧光信号，利用自动识别系统阅读荧光信号，自动判断检测结果。CTC分为上皮型、混合型和间质型，依据TOP2A表达量分为高、中、低和无表达。电话随访患者手术后肿瘤复发时间及生存状况。

三、统计学方法

采用SPSS 23.0统计分析软件进行描述性统计分析。分类变量报告为计数和百分比，连续变量报告为平均值和标准差，计数型资料采用χ2或Fisher精确检验。采用Kaplan-Meier法中的Log-rank法进行生存分析来计算影响患者生存时间及生存状态的因素，并绘制生存函数图。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、外周血CTC阳性率及CTC中EMT表型和TOP2A的表达

45例患者中有35例(77.8%)外周血中检出CTC，共检出CTC 160个，每个样本CTC检出范围0～17个，平均3.56个，中位数3个，其中上皮型40个(25.0%)、间质型53个(33.1%)、混合型67个(41.9%)。单个CTC水平的TOP2A高/中表达共108个(67.5%)，TOP2A低表达/无表达共52个(32.5%)。CTC中不同EMT表型间TOP2A表达量差异有统计学意义(χ2=9.375，P<0.05)，见表1。

表1 CTC上EMT 表型与TOP2A的表达[个(%)]

二、外周血CTC阳性率、数量、TOP2A表达及TOP2A高/中表达的EMT表型与肿瘤分期、病理分级的关系

卡方检验结果显示，非肌层浸润性膀胱癌(non-muscular invasive bladder cancer, NMIBC)与MIBC两组患者外周血CTC的阳性率、数量、TOP2A高/中表达、TOP2A高/中表达上皮型和TOP2A高/中表达间质型比较，差异有统计学意义(均P<0.05)；但对两组患者CTC上TOP2A高/中表达混合型检出情况进行比较时，发现差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。不同临床分期、病理分级膀胱癌患者外周血CTC的TOP2A高/中表达存在差异(χ2=11.24，P<0.05),T2～4G3患者检测到TOP2A高/中表达的CTC更多；但在不同临床分期、病理分级膀胱癌患者外周血CTC的阳性率、CTC检出数量、TOP2A高/中表达上皮型、TOP2A高/中表达混合型和TOP2A高/中表达间质型比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，见表3。研究结果显示，膀胱癌是否淋巴结转移与CTC检出、不同EMT表型、TOP2A表达及TOP2A高/中表达的EMT表型之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 外周血CTC检测数据与膀胱肿瘤浸润程度的关系[例(%)]

表3 外周血CTC检测数据与膀胱肿瘤不同临床分期及病理分级的关系[例(%)]

三、外周血CTC检出、数量、TOP2A表达与NMIBC及MIBC的无病生存期(disease-free survival time, DFS)和总生存期(overall survival, OS)的关系

45例患者中，41例随访2～74个月，失访4例，中位随访时间32个月，无病生存25例，死亡14例。在17例NMIBC患者中，失访2例，死亡0例，复发1例，而在28例MIBC患者中，失访2例，死亡14例，复发19例。通过KM法对17例NMIBC患者的随访结果进行生存分析，结果显示，未发现外周血CTC检出、数量、EMT表型及TOP2A表达与DFS及OS存在差异(P>0.05)。通过KM法对28例MIBC患者的随访结果进行生存分析，结果显示，DFS与CTC的检测阳性、TOP2A高/中表达及TOP2A高/中表达的间质型存在相关性(P<0.05)，未观察到DFS与CTC的数量及TOP2A高/中表达的混合型和上皮型存在相关性(P>0.05)。同时研究结果显示，OS与CTC的阳性及TOP2A高/中表达显著相关(P<0.05)，未观察到OS与CTC的数量及TOP2A高/中表达的不同EMT表型存在显著差异(P>0.05)。图1、图2分别为MIBC各组DFS和OS的KM曲线及P值。分别对图1中的各图分组进行差异性比较，因样本量(n=28，<40)较小,Fisher检验结果显示，MIBC复发转移与否与CTC阳性(P=0.007)、TOP2A高/中表达(P=0.003)及TOP2A高/中表达的间质型(P=0.013)之间差异有统计学意义；同样对图2中的各图分组进行差异性比较，Fisher检验结果显示，MIBC死亡与CTC阳性(P=0.04)及TOP2A高/中表达(P=0.021)之间差异有统计学意义。

A：CTC检测阳性vs CTC检测阴性；B：低CTC计数 vs 高CTC计数；C：TOP2A高/中表达vs TOP2A低/无表达；D：TOP2A高/中表达间质型 vs 非TOP2A高/中表达间质型；E：TOP2A高/中表达混合型 vs 非TOP2A高/中表达混合型；F：TOP2A高/中表达上皮型 vs 非TOP2A高/中表达上皮型图1 CTC上TOP2A和EMT表型与DFS的KM曲线

A：CTC检测阳性vs CTC检测阴性；B：低CTC计数 vs 高CTC计数；C：TOP2A高/中表达vs TOP2A低/无表达；D：TOP2A高/中表达间质型 vs 非TOP2A高/中表达间质型；E：TOP2A高/中表达混合型 vs 非TOP2A高/中表达混合型；F：TOP2A高/中表达上皮型 vs 非TOP2A高/中表达上皮型图2 CTC上TOP2A和EMT表型与OS的KM曲线

讨 论

CTC被认为是肿瘤转移性扩散的源头，CTC成为恶性肿瘤危险分层和治疗检测的重要工具[5-6]。尽管体内CTC的存在与膀胱癌预后不良有关[7-8]， 但许多患者即便体内存在CTC，也不一定会出现肿瘤的转移和复发，使得从单细胞水平上对CTC的表型特征及基因表达进一步研究变得尤为重要，可能发现更多与肿瘤转移及预后相关的信息。肿瘤细胞转移是一缓慢、低效而致命的过程，而研究认为EMT是大多数肿瘤生长和转移的必然过程[2，9-10]，CTC主要分为上皮型、混合型和间质型，其中间质型的恶性程度高，预后差，可能因间质型CTC是经EMT转换而来，使自身形态发生了改变，黏附能力降低，可塑性强，与更容易发生脱落转移有关。TOP2A是有丝分裂的重要核酶，研究已证实TOP2A的高表达与膀胱癌复发和预后不良密切相关[11-13]。

我们的研究发现，在MIBC中CTC阳性率较NMIBC更高，CTC与肿瘤浸润程度的关系与既往研究结论一致[3-5]；同时，T2～4G3和T2～4G1～2患者CTC阳性率较T1G3和T1G1～2更高，提示膀胱癌的T分期、病理分级越高，则外周血中检测出CTC的几率就越高；本研究中不同T分期和病理分级之间CTC阳性率差异无统计学意义(P=0.069)，可能与病例数少有关。此外，研究证实CTC数量越多，膀胱癌患者的预后越差[3,10，14-15]，本研究中CTC数量与DFS、OS无统计学差异，可能与病例数少以及CTC个数的多少定义为临界值有关。

本研究中，虽然大多数CTC阳性的患者检测到TOP2A表达，但TOP2A的表达模式在不同表型中不同。Turley等[16]研究发现肿瘤细胞中TOP2A表达水平较正常细胞更高。研究发现尿路上皮癌中TOP2A的高表达可能预示着肿瘤的侵袭性更高、预后更差[11，17-18]。我们研究发现MIBC和高级别膀胱癌患者的TOP2A水平均高于NMIBC和低级别膀胱癌，而且TOP2A高/中表达MIBC患者的DFS和OS明显低于TOP2A低/无表达患者，结果与既往研究一致[12,18]，即TOP2A的表达水平反映了肿瘤的侵袭性；但我们在NMIBC患者的随访检测中，未发现CTC中TOP2A高表达与肿瘤复发和生存之间存在差异，这可能与本研究病例数太少有关，增大样本量可能会产生有意义的结果。

肿瘤侵袭性与EMT密切相关，CTC可分为上皮型、混合型和间质型。张瑞赟等[19]研究表明，间质型和混合型在MIBC中检出率明显高于NMIBC，上皮型却无差异；金一等[20]研究发现，间质型是膀胱癌复发转移的独立危险因素；本研究未发现CTC表型与膀胱癌临床分期、病理分级存在统计学意义，但间质型在MIBC 17/28(60.7%)中的检出率较NMIBC 6/17(35.3%)多，统计学无意义可能是由于样本量太小，需进一步扩大样本量进行验证。在单个CTC水平上研究EMT表型和TOP2A共同表达发现，在MIBC中TOP2A高/中表达间质型的检出率更高，且TOP2A高/中表达间质型与DFS之间存在统计学意义，与OS之间差异无统计学意义，但其间质型中位OS明显短于混合型和上皮型，这可能与随访时间短或病例数少相关，故我们推测，当MIBC患者间质型CTC上TOP2A基因高表达时，出现疗效差、复发转移快的可能大。然而，我们在17例NMIBC患者的随访研究中，除2例失访，1例复发，其余患者均存活，未发现单个CTC上TOP2A和间质型共同表达与DFS、OS之间存在相关性，但二者共表达的中位DFS和OS均短于其他表型，可能与术后化疗、随访时间短及病例少等相关，尚需动态检测CTC、扩大样本量及延长随访时间等研究来进一步验证。此外，本研究未发现淋巴结转移与CTC检出、TOP2A表达及EMT表型的相关性，可能与肿瘤淋巴结转移机制与血性转移机制不同，无法通过CTC评估淋巴结转移情况[19]。

综上所述，不同EMT表型和TOP2A标记物在CTC中有着不同的表达模式，CTC上不同标记物在NIMBC和MIBC之间也存在差异，在MIBC患者中更常检测到TOP2A高/中表达和TOP2A高/中表达间质型的CTC，提示这些细胞可能在肿瘤侵袭和疾病进展过程中发挥一定作用，是肿瘤分期晚、预后差的原因，值得进一步研究来验证。