基于中药化学生物学理论探讨小青龙汤在肺系疾病中的靶点群及作用机制*

孙庆生，黄彭，曲佳琳，李希，张姗

1.郑州市中医院，河南 郑州 450000；2.大连医科大学附属第一医院中西医结合临床重点学科实验室，辽宁 大连 116011；3.河南睢县人民医院，河南 睢县 476900；4.潍坊市中医院，山东 潍坊 261000；5.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000

中药化学生物学作为中药化学和生物学的交叉而形成的新兴学科，是在中医药理论指导下，以生物信息学为工具，研究中药活性成分小分子作用靶点和对生命过程的调控作用［1］。中药生物化学的研究方法可以概括为中药活性成分的鉴定和筛选、靶点群的发现、作用靶点的生物学研究。小青龙汤出自《伤寒论》，由麻黄、芍药、细辛、炙甘草、干姜、桂枝、五味子、半夏等中药组成，具有辛温解表、温肺化饮之功效，用于治疗外寒里饮证。现代常用其治疗咳嗽、哮喘、支气管炎、肺炎、慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）、肺源性心脏病、肺间质纤维化、肺癌等肺系疾病［2］。研究表明，小青龙汤在治疗哮喘［3］、慢性支气管炎［4］、慢性阻塞性肺疾病［5］等肺系疾病方面确有疗效。本文基于中药化学生物学系统理论探讨小青龙汤和肺系疾病靶点群及生物学机制。

1 方法

1.1 小青龙汤活性成分筛选及其靶点预测小青龙汤各味药成分从中药系统药理学平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）收集，基于药物的吸收、分布、代谢、排泄（absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME）特性，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug-likeness，DL）作为筛选指标，筛选阈值设定为OB≥30%，DL≥0.18［6］。

基于筛选的活性化学成分，通过以下3种方法预测成分相关靶点：①TCMSPT，设定“Source”来源于“DrugBank”，DrugBank是一个生物信息学和化学信息学资源，涵盖了药物及其机制、相互作用关系和靶点信息，具有较高的数值可信度。②采用Pub-Chem数据库检索成分Canonical SMILES，从Swiss Target Prediction（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）预测相关靶点。根据其结果相关性，设定“probability≥0.5”［7］。③从PubChem数据库查询其2D结构，保存为SDF格式，然后将化合物上传到PharmMapper（http：／／lilab-ecust.cn／pharmmapper／）服务器。PharmMapper是一个药效团匹配与潜在识别靶标在线平台，能够进行基于药效团模型的成分潜在靶点预测，根据其结果相关性，选取“Norm Fit≥0.95”的靶点进行下一步分析［8］。最后通过Uniport（https：／／www.uniprot.org／）数据库将成分所对应的蛋白名称转化为基因名，限定物种为“human”，从而获取活性成分相应靶点。

1.2 肺系疾病相关靶点获取以肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病和间质性肺疾病为关键词从以下数据库中获取肺系疾病相关靶点：①DisGeNET（http：／／www.disgenet.org／）数据库；②GeneCards（https：／／www.genecards.org／）数据库；③CTD（http：／／ctdbase.org／）数据库。

1.3 蛋白互作（protein-protein interactions，PPI）网络的构建靶点通常不是作为单一个体发挥作用，而是作为动态网络中的成员发挥着整体协同作用。研究表明，PPI网络在许多生物学过程中发挥着重要的作用。研究靶点群之间相互作用，对进一步探讨其潜在作用机制至关重要。为了获取靶点PPI网络，通过STRING（https：／／string-db.org／）数据库对靶点群间的关系进行分析［9］，进一步揭示网络中的关键靶点。

为了更好地展示靶点群之间的关系，采用Cytoscape3.2.1软件进行网络构建并可视化处理。Cytoscape作为一个开源软件，将生物分子相互作用网络与其他分子状态集成到一个统一的概念框架中。此外，运用Cytoscape3.2.1中插件“Network Analyzer”功能对网络进行分析，可以获得自由度（Degree）等网络拓扑参数分用以析网络节点重要性。在一个网络图中，“节点”表示中药、成分、靶点或疾病，“边”是代表着两个节点之间的联系，节点的“度”是指与之相连的边的数目，度值越大，表明活性成分通过该靶点发挥的治疗作用越大［10］。

1.4 基因本体论（gene ontology，GO）生物学过程分析运用Metascape（http：／／metascape.org／gp／index.html＃／main／step1）对潜在作用靶点群进行基因本体论生物过程分析。Metascape作为一个整合了GO、Drugbank等数据库的在线工具，可用于生物过程注释分析，并且具有较高的时效性［11］。将上述潜在作用靶点导入Metascape，设置“species”为“Homo sapiens”，进行生物学过程分析。

1.5 京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析为进一步阐明小青龙汤治疗肺系疾病作用机制的异同，通过生物学信息注释数据库DAVID（https：／／david.ncifcrf.gov／home.jsp，V6.8）对潜在作用靶点进行KEGG通路富集分析［12］，设定“Background”为“Homo sapiens”，根据通路富集结果，并以P＜0.05作为显著功能和通路的临界值。

1.6 分子对接通过对小青龙汤治疗肺系疾病的靶点和机制急性网络拓扑学分析之后，筛选出度值较高的靶点和化合物后，运用SYBYL-X2.0软件进行分子对接验证。首先从RCSB蛋白质数据库（http：／／www.pdb.org／）下载候选蛋白的晶体结构（http：／／www.pdb.org／），从PubChem数据库中下载活性成分的SDF格式文件，通过软件进行去水、加氢和格式转换，计算活性化合物和靶点的结合分数，对接得分≥5分表示化合物与其靶基因之间有较好的结合作用。

2 结果

2.1 小青龙汤活性成分筛选和靶点预测小青龙汤各味中药成分从TCMSP收集，基于药物ADME特性，筛选阈值设定为OB≥30%，DL≥0.18，共获得的靶点为：半夏13个，甘草93个，干姜5个，桂枝7个，麻黄23个，芍药13个，五味子9个，细辛8个。基于所筛选的活性成分，从TCMSP、Swiss Target Prediction和PharmMapper预测得到成分相关靶点。

2.2 肺系疾病相关靶点的整理从DisGeNET、GeneCards和CTD数据库收集肺系疾病靶点，肺部感染共8 900个靶点、慢性支气管炎共1 867个靶点，肺气肿共1 331个靶点，慢性阻塞性肺疾病共6 869个靶点，肺源性心脏病共9 847个靶点，间质性肺疾病共4 076个靶点。

2.3 PPI网络的构建和靶点群分析探讨在肺部感染的诱因下，慢性支气管炎、肺气肿、慢阻肺、肺心病作为疾病的渐进性发展过程，将成分靶点映射到肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢阻肺、肺原性心脏病（简称肺心病）靶点中，获取交集67个靶点，采用STRING数据库获得靶点之间的关系，通过Cytoscape构建PPI网络图，见图1。从图中可以看出，白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、丝氨酸／苏氨酸蛋 白 激 酶（serine／threonine-protein kinase 1，AKT1）、TP53和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等靶点位于最内圈，可能是发挥主要治疗作用的靶点，将成分靶点映射到肺部感染、间质性肺炎和肺心病，获取160个交集靶点群，通过STRING和Cytoscape软件构建网络图，见图1，从图中可以看出，AKT1、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、TP53、IL-6和促分裂原活化蛋白激酶3（mitogenactivated protein kinase 3，MAPK3）等靶点位于最内侧，可能发挥着重要的作用。

为了研究小青龙汤在肺系疾病中的靶点群及作用机制的异同，将上述靶点群融合，去除重复靶点，共获得162个靶点，其中包含65个交集靶点。如图1所示，在这些靶点中，AKT1，VEGFA，IL-6，TP53和TNF等靶点具有较高的度值。基于肺部感染，从慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病到肺心病，CHRM1和GSTM2独立于交集之外，占交集靶点群的2.99%，涉及到其他靶点较少，主要和肺部感染有关。然而，从间质性肺炎到肺心病，VCAM1，PGR，MCL1和PIK3R1等95个靶点独立于交集靶点群之外，占交集靶点群59.38%。因此，除外肺部感染之外，间质性肺疾病和其他靶点相关性比较大，可能存在着其他的作用机制。

图1 小青龙汤在肺系疾病中的靶点群

2.4 基因本体论（Gene Ontology，GO）生物学过程异同分析采用Metascape在线分析平台，对上述67个和160个靶点群分别进行生物学过程分析，肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病交集靶点群共获得99条生物学过程（P＜0.001），肺部感染、间质性肺炎和肺心病获得125条生物学过程（P＜0.001），见图2。通过映射分析，两者共存在79条共同的生物学过程，主要涉及缺氧反应、凋亡过程的调控、MAPK级联的调控、一氧化氮生物合成过程的调控、细胞迁移的调控、细胞增殖的调控、炎症反应、成纤维细胞增殖的调控、细胞对缺氧的反应、对氧化应激的反应、白细胞迁移、自由基清除、ROS代谢过程的正调控、中性粒细胞趋化性等生物过程。除此之外，肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、肺心病涉及体液免疫反应、谷胱甘肽代谢过程、NF-κB转录因子活性的调控等20条生物过程，占全部生物过程的20.22%，肺部感染、间质性肺疾病和肺源性心脏病涉及RAS蛋白信号转导、细胞老化、地塞米松激发的细胞反应、类固醇生物合成过程、细胞对有机环化合物的反应、白三烯生物合成过程、肺发育等46条生物学过程，占全部生物过程36.8%。因此，在小青龙汤治疗肺系疾病的生物学过程，相同之处就是肺部感染，不同之处可能是疾病发展所特有的，其机制还需进一步研究。

图2 小青龙汤治疗肺系疾病生物学过程

2.5 KEGG通路富集分析为了研究靶点群在肺系疾病中的作用机制，将67个和160个靶点进行KEGG通路富集分析，见图3。肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病中67个靶点有45个靶点涉及36条通路，甘草在中药中的度值最大，其次是麻黄、半夏、细辛、桂枝、五味子、干姜、芍药，槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）和（kaempferol）等成分最有较高的度值，PTGS2，NOS2，PPARG，MAPK14，ADRB2PIK3 CG、MAPK1和NOS3等靶点的度值最高，在富集到的通路中，PI3K-AKT信号通路具有较高的度值，其次是Focal adhesion，TNF信号通路。

如图4所示，肺部感染、间质性肺疾病、肺源性心脏病中160个交集靶点有86个参与了38条通路，甘草在中药中的度值最大，其次是麻黄、半夏、细辛、桂枝、五味子、芍药、干姜，槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）和山奈酚（kaempferol）等成分最有较高的度值，PTGS2，NOS2，GSK3B，PPARG，CDK2，MAPK14，F10，CCNA2和PI3KCG等靶点的度值最高，在富集到的通路中，PI3K-AKT信号通路具有较高的度值，其次是Focal adhesion、TNF信号通路。

将图3和图4的靶点和通路进行融合，对比其中的异同，如图5所示，共计获得相同靶点42个，其中，MAPK1、MAPK13、PIK3CG、AKT1和MAPK8等靶点具有较高的度值；相同通路31条，其中PI3KAkt信号通路、TNF信号通路和MAPK信号通路等具有较高的度值。在这些共同的靶点及通路之外，肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病涉及Estrogen信号通路、Cytokine-cytokine receptor和Jak-STAT信号通路等，肺部感染、间质性肺炎和肺心病涉及cGMPPKG信号通路、p53信号通路、Leukocyte transendothelialmigration和Complement and coagulation cascades等。

图3 肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病交集靶点群通路富集分析

图4 肺部感染、间质性肺疾病和肺源性心脏病交集靶点通路富集分析

图5 小青龙汤治疗肺系疾病的靶点和机制的异同

基于度值最高的PI3K-AKT信号通路，对小青龙汤活性成分进行反向提取并构建网络，并运用分子对接对活性成分和靶点的结合作用进行研究。通过反向提取和网络构建，见图6。小青龙汤中甘草、麻黄、细辛等通过槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）和黄芩素（baicalein）等活性成分，作用于PI3KCG，NOS3和TP53等靶点群，介导PI3K-AKT信号通路在肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病、肺源性心脏病疾病的治疗中发挥作用。为了验证活性化合物和靶点群之间的结合作用，经拓扑学数据分析，对活性成分度值较高的槲皮素和靶点群（标黄）进行分子对接，MAPK1和VEGFA对接得分较高，为了更好的进一步确保结果的合理性及准确性，将治疗抗感染药物哌拉西林（piperacillin）、β2受体激动剂沙丁胺醇（salbutamol）和MAPK1，VEGFA进行分子对接，对接得分见图7，其对接构象见图10。

图6 小青龙汤治疗肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病中的PI3K-Akt信号通路

图7 小青龙汤治疗肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病疾病中槲皮素、哌拉西林、沙丁胺醇与靶点群分子对接得分

如图8所示，小青龙汤中甘草、麻黄、细辛等各味药通过槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）和山奈酚（kaempferol）等活性成分，作用于CDK2、GSK3B和PIK3CG等靶点群，介导PI3K-AKT信号通路在肺部感染、间质性肺疾病、肺源性心脏病疾病的治疗中发挥作用。为了验证活性化合物和靶点群之间的结合作用，对活性成分度值较高的槲皮素和靶点群（标黄）进行分子对接，见图9，CDK2和PTK2对接得分较高，对接构象见图10，为了更好的进一步确保结果的合理性及准确性，将治疗抗感染药物哌拉西林（piperacillin）、β2受体激动剂沙丁胺醇（salbutamol）和MAPK1、VEGFA进行分子对接，对接得分见图9，其对接构象见图10。

图8 小青龙汤治疗肺部感染、间质性肺疾病、肺源性心脏病中的PI3K-Akt信号通路

图9 小青龙汤治疗肺部感染、间质性肺疾病、肺源性心脏病疾病中槲皮素、哌拉西林、沙丁胺醇与靶点群分子对接得分

图10 槲皮素、哌拉西林、沙丁胺醇和MAPK 1、VEGFA、CDK2和PTK 2分子对接构象

2.6 基于PI3K-AKT信号通路研究小青龙汤治疗肺系疾病机制对靶点群进行通路富集分析，共计获得相同靶点42个。其中，MAPK1，MAPK13，PIK3CG，AKT1和MAPK8等靶点具有较高的度值；相同通路31条，其中PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路和MAPK信号通路等通路具有较高的度值。基于度值最高的PI3K-AKT信号通路，小青龙汤中甘草、麻黄、细辛等各味药通过槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）和黄芩素（baicalein）等活性成分，作用于PI3K、NOS3和TP53等靶点群，介导PI3K-Akt信号通路在肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病、肺源性心脏病疾病的治疗中发挥作用，槲皮素、木樨草素和黄芩素归属于黄酮类化合物，在体内外均具有抗炎活性［13-15］，分子对接结果槲皮素和MAPK1对接得分较高。通过PI3K-AKT信号通路结合靶点群进行综合分析，在肺部出现损伤后，大量ROS产生，可导致线粒体膜损伤和细胞色素C的释放，介导多功能转录调节因子NF-κB调节TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的释放，致使中性粒细胞浸润，见图11。研究表明，小青龙汤在慢性阻塞性肺损伤中通过降低NF-κB蛋白表达，减轻氧化应激损伤和炎症反

图11 基于PI3K-AKT信号通路研究小青龙汤治疗肺系疾病机制图

应［16］。

3 讨论

肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病、间质性肺疾病属于中医学“咳喘”“痰饮”“水气”“肿胀”等范畴。中医学认为，痰饮内停，外邪犯肺，肺失宣降，则痰随气升，气因痰阻，留于气道，发为咳喘，病机为本虚标实，本虚指气阴亏虚，标实指痰瘀交阻，水饮内停。小青龙汤中麻黄、桂枝相须为君，发汗散寒以解表邪，麻黄宣肺平喘，桂枝化气行水，可改善呼吸困难，喘促、胸闷等肺气阻遏之象；干姜、细辛为臣，温肺化饮，兼助麻黄、桂枝解表祛邪，然而素有痰饮，脾肺本虚，若纯用辛温发散，恐耗伤肺气，故佐以五味子敛肺止咳、芍药和养营血，配合宣通肺气药物，具有改善血液循环，纠正缺氧和二氧化碳潴留，改善紫绀现象，半夏燥湿化痰，和胃降逆，亦为佐药，使呼吸道炎性分泌物减少。本方还可以护卫正气，五味子、甘草可益气阴、补不足，体现了本虚标实，急则治标的原则。此方配伍特点是“散中有收，开中有合”，使风寒解，水饮去，宣降复，则诸症自平。

本研究基于TCMSP数据库，对小青龙汤中化学成分进行活性筛选，通过TCMSP、Swiss Target Prediction和Pharmmapper数据库筛选获得共248个活性靶点，采用数据库分别检索肺部感染、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病、间质性肺疾病相关靶点。基于肺部感染，通过映射分析、PPI网络构建及拓扑学数据计算，在65个交集靶点中，AKT，VEGFA，IL-6，TP53和TNF等靶点具有较高的度值，AKT包含3种密切相关的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3），通过一系列下游底物的丝氨酸和／或苏氨酸磷酸化来调节代谢、细胞增殖和血管生成等许多过程，在烟熏联合脂多糖气管滴注诱导气道慢性炎症的大鼠模型中［17］，加味小青龙汤通过调节肺脏AKT1 mRNA表达，减轻大鼠肺组织的病理形态学的损伤，保护COPD大鼠。IL-6是细胞因子网络中的重要成员，在急性炎症反应中处于中心地位，IL-6产生后诱导产生C反应蛋白和降钙素原生成，与炎症性疾病及感染程度直接相关。TNF-α是由单核巨噬细胞产生，与机体炎症密切相关，在临床观察性试验中［18］，小青龙汤通过降低血清TNF-α和IL-6的表达水平发挥治疗慢性支气管炎的作用。基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）能够降低细胞外基质，MMP-9作为MMPS家族重要成员，给予小青龙汤治疗慢阻肺患者后可诱导痰细胞总数和中性粒细胞比例降低，还可诱导痰MMP-9水平也降低［19］。作为慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病发展的终末阶段，而肺部感染会引起心力衰竭急性发作，导致患者出现端坐呼吸以及大汗淋漓等急性肺水肿的表现。此外，部分间质性肺疾病可能与感染有关，感染也是急性加重的一个重要因素，因此，在间质性肺疾病的治疗中，虽然没有较多的文献研究关于疾病靶点和小青龙汤在间质性肺疾病治疗中的作用，但是，小青龙汤在肺部感染中的治疗作用值得进一步去深入研究靶点和间质性肺疾病之间的关系。

通过对靶点群的生物学过程分析，基于肺部感染的共同生物学途径主要涉及缺氧反应、凋亡过程的调控、MAPK级联的调控、NO生物合成过程的调控、细胞迁移的调控、细胞增殖的调控、炎症反应、成纤维细胞增殖的调控、细胞对缺氧的反应、对氧化应激的反应、白细胞迁移、自由基清除、活性氧（reactive oxygen species，ROS）代谢过程的正调控、中性粒细胞趋化性等生物过程。从病理生理学角度分析，肺部感染时可导致肺部呼吸面积明显减少，导致血液气体交换功能障碍，从而影响通气／血流比值失调，并可引起动-静脉分流增加而导致低氧血症，造成机体组织缺氧，缺氧致体内ROS增多，发生氧化应激反应，进而损伤气道上皮，能够使抗蛋白水解酶失活，加重肺部微血管中中性粒细胞的聚集，使致炎因子表达升高。此外，氧化应激也可导致肺泡上皮损伤，激活JNK、p38 MAPK激酶通路，从而诱导细胞凋亡。研究表明，在烟雾诱导的慢性阻塞性肺病大鼠实验模型中，小青龙汤能够纠正氧化抗氧化失衡，减轻炎症反应的作用［20］，在肺源性心脏病发病过程中，小青龙汤可以缓解持续性低氧引起体内氧化应激产物增多，抑制NF-κB转录因子活性［21］，临床试验对比研究表明，通过对寒饮伏肺型肺源性心脏病患者观察，在吸氧、抗炎、解痉平喘等西药治疗的基础上，联合小青龙汤治疗，能够提高疗效［22］。在间质性肺疾病中，RAS表达产物明显增多，可能与间质性肺病的发生有关［23］。

此外，NF-κB可以影响PTGS2的表达，激活MMP2和MMP9，引起中性粒细胞激活和跨内皮迁移，临床研究表明，在慢性阻塞性肺病患者中，与单纯使用沙美特罗替卡松组相比，给予沙美特罗替卡松粉联合小青龙汤治疗方案，MMP-9水平显著下降［24］。AKT磷酸化后被激活，p-Akt通过磷酸化激活eNOS，eNOS是合成NO的关键限速酶，从而调控NO的生成过程，调节心血管体内平衡，促进血管平滑肌细胞松弛，降低血管阻力，减轻心脏负荷，缓解心肺症状，小青龙汤能够产生NO来调节血管紧张度、血管通透性和血管平滑肌细胞的增殖，NO分子小且能够穿过细胞膜到达血管周围的平滑肌细胞，使血管扩张，对维持肺循环稳态具有重要意义［25］。趋化因子在肺部疾病炎症反应中也有关键作用，通过调控PTK2的表达，作用于MAPKs信号级联，进一步调控下游信号的转导发挥治疗作用。GSK3B属于GSK3的一种亚型，活化的ATK可通过磷酸化，使GSK3B失去活性，调节CDK2的表达，小青龙汤可能通过介导PI3K-AKT，调节GSK3B的表达来发挥抗炎作用。

基于中药化学生物学理论，应用生物信息学对小青龙汤中的活性化学成分筛选、靶点预测、生物学过程分析、KEGG通路富集分析和分子对接分析发现，在肺系疾病发展过程中，氧化应激处于肺损伤的首位，通过抗氧化应激反应，细胞因子作用于Ras，激活PI3K-AKT信号通路，进一步调节下游靶点，发挥抗炎、扩血管等作用，在肺疾病的发生和发展中发挥着重要的作用，为小青龙汤在肺系疾病中的进一步的研究奠定了理论基础。