反复冷-热刺激对大鼠鼻黏膜免疫屏障功能的影响及中医解表方的作用研究

杨居崩,赵显芳,聂发龙,肖纯,代蓉,李秀芳

(云南中医药大学,昆明 650500)

近年来,随着SARS病毒[1-2]、MERS病毒[3-4]、H1N1流感病毒[5-6]、H7N9禽流感病毒[7-8]的相继肆虐,目前,新型冠状病毒肺炎在全球流行[9-13],呼吸系统感染性疾病的防治引起了全世界广泛的关注,这些高致病性病毒的共同特点是均可由呼吸道进入机体进而引发疾病,并且它们的传播途径也主要是呼吸道,其中肺炎等严重的下呼吸道感染(lower respiratory tract infection,LRTI)往往始于上呼吸道感染(upper respiratory tract infection,URTI)研究证实[12],冠状病毒及流感病毒引起的严重感染均与呼吸道黏膜屏障结构破坏或功能低下密切相关,提高呼吸道黏膜屏障的防御能力是防治呼吸系统感染性疾病的重要途径之一。上呼吸道覆盖于除鼻前庭外鼻腔结构的鼻黏膜,直接与外界接触,是机体与吸入抗原及病原体接触的第一个部位,也是机体天然免疫系统的重要组成部分,其不仅具有一般性的机械屏障作用,还参与体液免疫和细胞免疫过程,是执行局部非特异性免疫功能的主要场所。鼻黏膜免疫屏障的功能易受多种因素的影响,其中,温度变化的刺激尤其重要。研究表明[14-15],暴露在寒冷的气候环境中会增加机体对普通感冒的易感性,其原因与寒冷刺激引起机体免疫功能抑制,病毒在低温环境下更容易复制等因素有关[16]。为进一步考察温度变化的刺激对SD大鼠鼻黏膜局部免疫功能及机体炎症反应的影响,本实验采用冷-热循环刺激的方式干预SD大鼠,检测其鼻黏膜免疫屏障相关效应分子的变化,并同时考察了循环系统中炎症因子的变化。

解表方是中医临床治疗表证的常用方剂,由于中医表证症状的描述与现代医学的URTI症状非常相似,故中医常用解表方治疗上呼吸道感染,并取得了较好的效果。课题组前期研究发现解表方麻黄汤和银翘散均可提高寒冷所致上呼吸道黏膜屏障功能低下模型小鼠唾液中sIgA的含量,对鼻腔接种乙型溶血性链球菌感染小鼠有生存保护作用[17],提示,两个解表方治疗上呼吸道感染的机制与其提高上呼吸道黏膜免疫功能有关。因此在本实验中同时对这两个解表方的作用进行了考察。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

120只SPF级雄性SD大鼠,8周龄,体重180～200 g,购于成都达硕实验动物有限公司【SCXK(川)2020-030】,饲养于云南中医药大学动物实验室【SYXK(滇)K2017-0005】,饲养期间各组大鼠自由饮水,饲喂普通维持饲料由成都达硕实验动物有限公司提供。饲养环境:昼夜各半循环照明,湿度恒定,温度控制在22～25℃。所有操作均符合云南中医药大学实验动物伦理学要求(审批号:R-082018034)。

1.1.2 主要试剂与仪器

BCA蛋白浓度检测试剂盒(Beyotime,P0010),RIPA裂解液(强)(Beyotime,P0013B),吐温-20(Biofroxx,1247ML100),过硫酰胺(Sangon Biotech,A600072-0025),10% SDS(Sangon Biotech,B548118),Tris(Genview,BT350-500G),四甲基乙二胺(Cellcook,A100761-0100),甘氨酸(Biofroxx,1275GR5009),DTT(Sangon Biotech,A620058-0025),1 mol/L Tris-HCL缓冲液(Solarbio,T1020),1.5 mol/L Tris-HCL缓冲液(Solarbio,T1010),30%丙烯酰胺缓冲液(Solarbio,A1010),Anti-IgA(Novus Biologicals,NB7501);Anti-Goat(Proteintech,SA00001-4),Anti-Rabbit(Proteintech,SA00001-2),Anti-beta Actin(Proteintech,20536-1-AP),溶菌酶(南京建成生物工程研究所,A050-1-1),PGE2(南京建成生物工程研究所,H099-1),TNF-α(南京建成生物工程研究所,H052-1),IL-1β(南京建成生物工程研究所,H002),IL-6(南京建成生物工程研究所,H007-1-2),sIgA(南京建成生物工程研究所,H108-2)。

酶标仪(Tecan,Infinite M200 PRO,瑞士),垂直电泳仪(Bio-Rad,EPS-301,美国),湿转仪(Bio-Rad,18113002,美国),UVP凝胶成像分析系统(Bio Spectrum,美国),分析天平(Precisa,XS125A,瑞士),冰箱(青岛海尔,BCD-392MNE,中国)。

1.1.3 实验药物

银翘散:按《方剂学》[18]配伍比例,称取银翘散,全方除薄荷、荆芥外,12倍水浸泡30 min,煎煮15 min,在10 min时加入薄荷、荆芥。纱布滤过,再经真空抽滤后液体在40°旋蒸至所需浓度相应体积。大鼠的给药剂量为临床等效量(16.74 g生药/kg体重)的2倍(33.48 g生药/kg体重)。

麻黄汤:按《方剂学》[18]配伍比例,称取麻黄汤,10倍水浸泡全方30 min,先煎麻黄20 min,再与余药共煎30 min,纱布滤过,再经真空抽滤后液体在55°旋蒸至所需浓度相应体积。大鼠的给药剂量为换算成人临床等效量2.43 g生药/kg体重。

1.2 方法

1.2.1 单轮冷-热刺激对大鼠鼻黏膜免疫功能及血清炎症指标的影响

参考文献[19]稍作修改,取雄性SD大鼠54只,随机分为阴性对照组、模型组。造模前禁食不禁水12 h,正常组不予任何刺激;模型组将动物先置于-15℃环境中1 h,再转移入25℃环境30 min,循环4次,造模结束后恢复进食。模型组于寒冷刺激后0、6 h、1、3、5、7、9、11 d每个时间点取6只动物,常规方法制备鼻黏膜组织、血清、鼻腔灌洗液,用Western Blot法检测鼻黏膜组织中IgA的蛋白表达,以IgA蛋白表达最低的时间点,ELISA试剂盒检测大鼠鼻腔灌洗液中溶菌酶、sIgA及PEG2含量,及血清中的PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.2 两轮冷-热刺激对大鼠鼻黏膜免疫功能及血清炎症指标的影响

取雄性SD大鼠42只,随机分为阴性对照组、模型组。造模前禁食不禁水12 h,正常组不予任何刺激;各模型组将动物先置于-15℃环境中1 h,再转移入25℃环境30 min,循环4次,造模结束后恢复进食,各组动物在刺激结束后第9天,再次采用相同的冷-热刺激条件刺激大鼠,各组动物于再次刺激后1、3、5、7、9、11 d每个时间点取6只动物,常规方法制备鼻黏膜组织、血清及鼻腔灌洗液,Western Blot法检测鼻黏膜组织IgA的蛋白表达,ELISA试剂盒检测鼻腔灌洗液中溶菌酶、sIgA及PEG2的含量,以及血清中PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.3 解表方对两轮冷-热刺激致大鼠鼻黏膜免疫屏障功能下降的影响

取雄性SD大鼠24只,随机分为阴性对照组、模型组、银翘散组和麻黄汤组。造模前禁食不禁水12 h,正常组不予任何刺激;其余各组进行首次寒冷刺激,在造模6 h后,正常组和模型组灌胃给予蒸馏水(1 mL/100 g),银翘散组和麻黄汤组给予相应的药物(1 mL/100 g),连续给予7 d,每天1次,在第9天时进行第2次寒冷刺激,阴性对照组和模型组在第2次寒冷刺激后6 h后灌胃给予蒸馏水,银翘散组和麻黄汤组给予相应的药物,22 h时再灌胃给予受试物1次,24 h时按常规方法制备血清、鼻腔灌洗液和鼻黏膜组织。鼻黏膜组织用于检测IgA的蛋白表达,大鼠鼻腔灌洗液用于检测溶菌酶、sIgA及PGE2的含量,血清用于检测血清中PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 单轮冷-热刺激对大鼠鼻黏膜免疫功能及血清炎症指标的影响

结果显示,SD大鼠在-15℃环境中1 h,再转移入25℃环境30 min,循环4次刺激后,随着时间的延长,鼻黏膜中IgA(图1a)蛋白表达持续下降(P＜0.05);单轮冷-热刺激后1 d,与阴性对照组相比,模型组大鼠鼻腔灌洗液中sIgA(图1b)的含量降低(P＜0.05),而溶菌酶、PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β(图1c,1d,1e,1f,1g,1h)无明显差异(P＜0.05)。

2.2 两轮冷-热刺激对大鼠鼻黏膜免疫功能及血清炎症指标的影响

结果显示,大鼠在单轮冷-热刺激后第9天,对大鼠进行再次刺激后,随着时间的延长,大鼠鼻黏膜中IgA(图2a)蛋白表达持续下降(P＜0.05),刺激后1、3、11 d时鼻腔灌洗液中溶菌酶(图2b)的含量明显低于对照组动物(P＜0.05);刺激后1 d时鼻腔灌洗液中sIgA(图2c)含量明显高低于对照组动物(P＜0.05);与阴性对照组相比,1、3 d时模型组血清中PGE2(图2d)的含量明显高于对照组动物(P＜0.05);而鼻腔灌洗液中的PGE2(图2e),1、3 d时含量明显低于对照组(P＜0.05);血清中的TNF-α(图2f)含量持续上升,1、3、5、7、11 d时血清中TNF-α的含量明显高于对照组(P＜0.05);刺激后1、11 d时血清中IL-6(图2g)的含量明显对照组动物(P＜0.05);1、3、11 d时血清中IL-1β(图2h)的含量明显高于对照组(P＜0.05)(见图2)。

图2 两轮冷-热刺激对大鼠鼻黏膜免疫功能及血清炎症指标的影响Figure 2 Effects of two rounds of cold-warm stimulation on immune function of nasal mucosa and serum inflammatory indexes in rats

2.3 单轮刺激与两轮刺激大鼠鼻黏膜组织IgA蛋白含量的动态变化结果对比

为了比较SD大鼠受到单轮冷-热刺激与两轮冷-热刺激后,鼻黏膜中IgA蛋白表达的差异,结果显示,SD大鼠再次受到刺激后,随着时间的延长,鼻黏膜中IgA蛋白表达持续下降,恢复速率更慢,1、3、9 d鼻黏膜中IgA蛋白明显低于单轮刺激动物(P＜0.05)(见图3)。

2.4 解表方对两轮冷-热刺激致大鼠鼻黏膜免疫屏障功能下降的影响

结果显示,与阴性对照组比较,模型组大鼠鼻黏膜中IgA蛋白表达、鼻腔灌洗液中溶菌酶和sIgA明显降低(P＜0.05),而血清中的炎症因子PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β均明显升高(P＜0.05);与模型组比较,银翘散组大鼠鼻黏膜IgA蛋白表达、鼻腔灌洗液中溶菌酶含量和sIgA含量均明显升高,血清中的炎症因子PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量均明显下降(P＜0.05);与模型组比较,麻黄汤组大鼠鼻黏膜IgA蛋白表达、鼻腔灌洗液中的sIgA含量均明显升高,而血清中仅IL-1β含量下降,PGE2、TNF-α、IL-6含量无明显差异(P＞0.05)(见图4)。

3 讨论

URTI常发生于季节交替之时[20-22],其症状为鼻塞、流涕、喉咙痛、咳嗽以及打喷嚏等[23-24],为自限性疾病,但可发展为肺炎、支气管炎等严重的LRTI,特别是老人、婴幼儿以及具有潜在疾病的人可能造成致命后果[25-27],研究表明,大多数呼吸道病毒感染具有季节性。在温带地区,URTI在秋季和春季出现的频率增加,并在整个冬季高度流行[22,28]。冬季寒冷、干燥的气候特点是呼吸道感染增加的主要驱动因素,可促使病毒稳定性增加并加快传播,削弱宿主的免疫系统[29-31],如2002～2003年重症急性呼吸综合征(SARS-CoV)和最近出现的新型冠状病毒肺炎(SARS-CoV-2)等[32-35]进一步表明了冬季环境容易促进各种呼吸道病毒感染的传播,并在健康人群中高度流行,研究表明[36-37]人体暴露于寒冷环境中会增加呼吸道感染的风险及其严重程度,每年冬季都会因气温的下降而导致死亡率和发病率的大幅上升,其死亡率比其他季节平均高出26%,其中24%的人死于呼吸系统疾病[38]。另外平均气温每降低1℃,冬季死亡人数就增加8000人[39]。根据英国230名全科医生在1970年8月至1991年7月期间统计的每万名登记病人的发病率数据显示[40],随着气温的下降,流感样疾病的发病率增加,发病高峰出现在2月份平均温度最低的时期,其最大的因素是呼吸冷空气会导致气道降温,从而导致呼吸道上皮温度下降,并降低局部呼吸防御功能,如降低粘液纤毛清除率和抑制白细胞吞噬,最终导致呼吸道感染[41-42]。呼吸道黏膜免疫系统是机体抵御经口鼻入侵病原体的第一道防线,鼻黏膜作为RMIS的重要组成部分,也是病原体入侵的首个接触部位,鼻黏膜免疫功能低下是URTI发生的重要原因,也与URTI反复发作密切相关,故维持鼻黏膜屏障功能的完整性对于URTI防治具有重要意义。结合临床的这些研究报道,本实验探讨了反复冷-热刺激对大鼠鼻黏膜免疫屏障功能的影响,并考察了中医常用解表方麻黄汤和银翘散的作用。

sIgA作为黏膜免疫系统的主要效应分子,可通过限制病原体的上皮定植,防止病原体进入黏膜上皮,保护黏膜表面免受环境病原体和抗原的侵害[43-45]。溶菌酶是体液中的非特异性杀菌物质,可反映机体非特异性免疫机能的水平,溶菌酶含量下降,则机体局部抗菌、抗感染能力下降[46-47]。当受到反复的冷-热刺激后,SD大鼠鼻黏膜IgA蛋白表达明显下降,在刺激后的第1天表达最低,此时鼻腔灌洗中分泌型的sIgA显著下降,但溶菌酶含量无明显变化,血清中炎症介质PGE2及炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β也都无明显变化,在刺激后的3 d内,SD大鼠鼻黏膜IgA蛋白均呈低表达,但第3天后开始呈上升趋势,至第7天则完全恢复至正常水平,提示,在短暂的反复冷-热刺激后,会使得鼻黏膜的免疫屏障功能暂时低下,但此时机体的炎症反应不明显。

研究显示,小鼠在初次感染细菌或病毒性肺炎后即使被治愈,再次感染肺炎的机率也会明显升高,会出现免疫系统对相同致病因素的反应性下降的现象[48]。在本实验研究中,大鼠受到单轮冷-热刺激后7 d鼻黏膜中IgA蛋白表达就能恢复正常,那如果大鼠再次受到相同条件的冷-热刺激时,大鼠鼻黏膜免疫效应分子IgA是否能够再次在短时间内恢复正常呢?为了回答这个问题,大鼠在单轮冷-热刺激后的第9天,对大鼠进行相同条件的再次冷-热刺激,结果发现,再次刺激后,随着时间的延长,大鼠鼻黏膜中IgA蛋白表达持续下降,刺激后1、3、9 d鼻黏膜中IgA蛋白表达明显低于单轮冷-热刺激,虽然鼻黏膜中IgA蛋白表达在3 d后也呈上升趋势,但较单轮冷-热刺激后上升速率更慢,至第11天时,鼻黏膜中IgA蛋白表达也未恢复正常,同时,再次的冷-热刺激后,模型大鼠鼻腔灌洗液中sIgA和溶菌酶的含量均显著下降,血清中PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β均显著升高,提示,大鼠在受到冷-热刺激后,即使鼻黏膜中IgA蛋白表达恢复正常,再次受到冷-热刺激后,鼻黏膜免疫系统功能下降会更明显,机体的防御能力下降,这可能与机体受到反复的冷-热刺激后会造成上呼吸道感染的易感性提高的原因相关。

银翘散源于《温病条例》,由清代温病学家吴鞠通创制,是中医用于治疗风热表证的代表方,使用至今已有两百多年历史,具有辛凉透表、清热解毒的功效,主要用于温病初起,微恶风寒,头痛口渴,咳嗽咽痛,舌尖红,苔薄白或薄黄,脉浮数等。麻黄汤源于张仲景所著《伤寒论》,是中医用于治疗风寒表证的代表方,具有发汗解表、宣肺平喘、利水消肿的功效,主治外感风寒表实证,恶寒发热,头身疼痛,无汗而喘,舌苔薄白,脉浮紧等。由于两个解表方的主治病症与现代医学中URTI的临床症状非常相似,因此,两个解表方被广泛用于URTI的治疗,在临床上显示了较好的疗效。本研究的结果显示,反复冷-热刺激后,SD大鼠鼻黏膜IgA蛋白表达明显下降,鼻腔灌洗中分泌型的sIgA显著下降,提示鼻黏膜的免疫屏障功能下降,分别给予麻黄汤和银翘散后,均能升高鼻黏膜IgA的蛋白表达和鼻腔灌洗中sIgA的含量,并且以麻黄汤提高鼻黏膜IgA的蛋白表达的作用更加明显。提示,麻黄汤侧重于促进鼻黏膜IgA的蛋白表达来发挥提高鼻黏膜免疫功能的作用。银翘散组溶菌酶的含量升高,麻黄汤组无明显变化,提示银翘散可通过提高sIgA、溶菌酶的含量而发挥增强鼻腔局部非特异性免疫功能的作用。再次冷-热刺激导致SD大鼠多种炎症因子明显升高,银翘散和麻黄汤对大鼠鼻腔灌洗液中和血清中PGE2均无明显影响,但银翘散可显著降低模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量,提示其具有减轻炎症反应的作用,麻黄汤仅能降低IL-1β的含量,提示,银翘散在缓解炎症反应方面作用更为突出。本研究显示,不同药性的麻黄汤与银翘散对寒冷刺激致大鼠鼻黏膜免疫功能低下模型具有相同的作用也有不同的作用,但其具体的作用机制尚不清楚,因此在后续的研究中将对两种解表方的作用机制进行深入研究。为临床治疗URTI提供科学的理论依据。