微囊藻毒素-LR对小鼠原代肝细胞线粒体功能的影响

贺云,陈艺生,任岚,尹一杰,胡桂玲,吴云丽*

(1.福建医科大学基础医学院,消化道恶性肿瘤教育部重点实验室,福建省肿瘤微生物学重点实验室,福州 350122;2.福建省立医院临床医学实验研究中心,福州 350001)

随着水体富营养化的加剧,蓝藻水华给生态环境造成极大压力。微囊藻毒素(microcystins,MCs)是蓝藻细菌的次级代谢产物,为单环七肽活性化合物,具有多脏器毒性,如肝毒性、肾毒性、神经毒性、心脏毒性以及肠道菌群改变等,可通过饮水、食物链传递及水上活动等方式进入动物和人体内,对人体及动物健康造成严重威胁[1-3]。MCs具百余种异构体,其中分布最广,毒性最强的是微囊藻毒素LR(Microcystin-LR,MC-LR)[4],被国际癌症研究机构(International Agency for Research in Cancer,IARC)定义为可致人类癌症的风险因素(IIB类)。肝作为MC-LR累积与作用的靶器官,极易受到损害,研究表明MC-LR可引起肝细胞病理学改变:肿胀、炎症,产生活性氧自由基并引起不可逆转的DNA损伤,与肝细胞坏死、肝癌发生具有密切联系[5-7]。然而,MC-LR的肝毒性机制及致癌机制尚不明确,此前很大一部分研究将细胞死亡归因于MC-LR引起的氧化应激[5,8-10],线粒体功能改变在MC-LR诱导的氧化应激中发挥关键作用,甚至在诱导肝细胞死亡以及癌症发生发展过程中起重要作用[10]。至于MCLR如何诱发线粒体功能障碍方面的研究比较欠缺,具体机制尚不明朗。基于以上分析,该课题以小鼠原代肝细胞为模型,从分子水平上评估MC-LR造成线粒体功能异常的机制,旨在为MC-LR相关肝疾病的诊断和治疗策略提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

9只28日龄SPF雄性C57BL/6小鼠,体重约为10 g,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司【SCXK(沪)2017-0005】。饲养于福建医科大学实验动物中心【SYXK(闽)2016-007】,昼夜各半循环照明,相对湿度40%～70%,温度在20～25℃之间。采用无菌营养颗粒料饲料,饮用水为高压的纯净水,自由采食。动物实验通过福建医科大学动物伦理委员会审查(FJMU IACUC 2020-0115)。

1.1.2 主要试剂与仪器

MC-LR(ENZO,ALX-350-012),IV型胶原酶(sigma,C5138),胎牛血清(PAN,P30-3302),青霉素和链霉素双抗生素溶液(Gibico,15140-122),ATP检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司,S0026),MitoProbeTMJC-1 Assay Kit(Invitrogen,34152),Reagent Kit for Single Cell Gel Electrophoresis Assay(Trevigen,4250-050-K),Mouse 8-Hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG)ELISA Kit(华美生物,CBS-E10527),GAPDH(Cell Signal,2118),p53(Cell Signal,2524)。

冷光仪(Berthold,德国),激光共聚焦显微镜(Leica,德国),荧光显微镜(Leica,德国),分子成像仪(ImageQuant LAS 4000 mini,美国),多功能酶标仪(Bio-Tek,美国)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代肝细胞提取

采用改良二步灌注法分离提取原代肝细胞。28日龄雄性小鼠深度麻醉后,开腹,从下腔静脉进针,剪断肝沿静脉,匀速灌注20 mL不含钙离子的KRB缓冲液,待血液冲洗干净后,换成20 mL含有0.5%(w/v)IV型胶原酶的灌注液同法操作。灌注完成后,摘下肝,释放细胞,通过3次低温低速离心去除杂质和死细胞。

1.2.2 细胞培养和毒素处理

纯化的原代细胞以合适的密度种植于鼠尾胶原包被的孔板中,使用含有10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素双抗生素溶液的DMEM培养基,放入含5% CO2的37℃培养箱中培养。贴壁后,加入0～10 nmol/L不同浓度MC-LR毒素进行细胞染毒,以未加MC-LR的细胞为对照,培养48 h,进行后续试验检测。p53抑制剂pft-α(5 μmol/L)使用时间为处理毒素前1 h。

1.2.3 线粒体功能检测

该实验中细胞内的ATP水平是由基于生物发光技术进行的,首先,冰上裂解细胞,4°C 12 000 rpm离心10 min,取上清备用。使用ATP检测试剂盒中ATP检测工作液将检测板中作用5 min,以降低本底。加入样品,迅速混匀,立即用冷光仪测定CPM值。根据标准曲线计算样品ATP浓度。

该研究使用MitoProbeTMJC-1 Assay Kit,进行线粒体膜电位检测,具体步骤如下:用PBS缓冲液清洗细胞,加入终浓度为10 μg/mL JC-1染料,置于37°C培养箱中,避光孵育20 min,PBS洗涤2次,使用激光共聚焦显微镜在488 nm激发波长下观察,拍照,并用LAS AF LITE软件计算各实验组的荧光强度。

1.2.4 DNA损伤检测

彗星试验(comet试验):使用Reagent Kit for Single Cell Gel Electrophoresis Assay检测细胞DNA双链完整性。细胞用胰酶消化后,离心收集细胞,混合于低熔点琼脂糖中,转移至载玻片,低温冷却凝固,于4℃预冷的细胞裂解液中裂解过夜。次日取出,用pH＞13的碱性电泳液中避光电泳30 min。电泳结束后,清洗,染色,荧光显微镜观察,拍照。

使用Mouse 8-Hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG)ELISA Kit检测8-OHdG生成水平:裂解细胞,取细胞上清,用样品稀释液稀释20倍。使用HRP标记待测样品,培养箱中孵育30 min后,洗板3次,显色后,用多功能酶标仪测定450 nm处吸光度值。根据标准曲线计算相应8-OHdG浓度。

1.2.5 Western Blot检测

提取细胞蛋白后,采用BCA蛋白定量法进行定量检测。取30 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳,蛋白低温转移至PVDF膜,GAPDH,p53抗体孵育过夜,HRP标记的二抗处理后,洗膜3次,使用分子成像仪进行曝光显影,拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MC-LR造成线粒体功能障碍

为了检测线粒体功能,从线粒体膜电位(MMP,Δψm)的变化和细胞能量代谢(ATP)变化两个方面进行研究。首先,检测了ATP生成水平,结果如图1 A所示,与对照组相比,低剂量2.5 nmol/L MC-LR处理组就可以使ATP水平降低至0.78±0.05倍(P＜0.05),随着毒素浓度的增加,ATP生成量不断减少(5 nmol/L组为0.69±0.10倍,10 nmol/L组为0.38±0.05倍,P＜0.05),这一作用迅速而又明显。接着,检测了线粒体膜电位。敏感的JC-1染料以电势依赖性的方式积聚在线粒体内,正常情况下为聚合物状态,产生红色荧光,线粒体处于异常状态,JC-1则分解为单体,发绿色荧光,线粒体膜电位的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。如图1B所示,MC-LR作用48 h后,细胞内红色荧光逐渐减弱,绿色荧光逐渐增强,聚合物逐渐解离成单体。通过计算,空白对照组的膜电位比较高,红/绿色平均荧光强度比值为2.93±0.53,而毒素处理组比值逐渐降低,分别为:2.48±0.29,1.67±0.43,1.53±0.36(P＜0.05),影像学图片和计算的数据共同表明线粒体膜电位去极化。综合以上结果,说明MC-LR导致线粒体功能受到损害。

注:不同剂量(2.5～10 nmol/L)MC-LR处理小鼠原代肝细胞48 h;A:ATP水平与对照组比较,*P＜0.05;B:JC-1染色激光共聚焦拍照;与对照组相比,*P＜0.05。图1 MC-LR引起肝细胞线粒体损伤Note.Hepatocytes were treated with 2.5～10 nmol/L MC-LR for 48 h.A.Comparison of ATP level in cells subjected to the indicated treatments,*P＜0.05.B.Representative confocal imaging of cells treated with the indicated treatments.Compared with normal control group,*P＜0.05.Figure 1 Effect on mitochondrial function of hepatocytes induced by MC-LR

2.2 MC-LR造成肝细胞DNA损伤

采用彗星实验和8-OHdG水平检测评价MC-LR对肝细胞DNA的损伤作用。通过彗星实验影像通过观察DNA彗尾形状和迁移模式,可判断DNA双链是否发生断裂,从单个细胞水平评估细胞的DNA损伤。研究中,如图2A所示,对照组细胞核为圆形,未出现拖尾,其头部的荧光强度高,MC-LR处理后,单个细胞核拖尾增大,头部与尾部所占比例发生变化,且随着处理毒素浓度增加,拖尾明显变长,体积变大。分析DNA百分比含量(图2B),MC-LR处理后,细胞核尾部DNA百分比的显著增加,相反的,头部DNA百分比逐步降低。进而该研究检测了另一个重要指标的尾力矩(olive tail moment,OTM),如图2C,从单个细胞水平上进行测量,发现对照组的OTM为5.72±3.56,随着毒素浓度增加,OTM最高增加到47.96±2.92(10 nmol/L,P＜0.05)。8-OHdG作为DNA损伤的生物学标记[11],当细胞发生损伤其浓度急剧升高,为了检测DNA损伤的发生情况,该研究检测肝细胞的生长培养基中8-OHdG的含量。图2D实验结果表明,经过梯度浓度的MC-LR处理48 h后,培养基中8-OHdG水平变化范围从1.02±0.03倍(2.5 nmol/L组,P＜0.05)增加到1.51±0.07(10 nmol/L组,P＜0.05),均高于对照组。以上实验结果表明MC-LR促使细胞DNA双链断裂,并使8-OHdG高表达,导致DNA损伤。

2.3 MC-LR通过p53调控线粒体功能损伤作用

DNA损伤往往造成p53表达增加,为探索p53表达情况,通过Western Blot对细胞内p53蛋白进行检测,结果显示,5 nmol/L MC-LR处理组的肝细胞内p53蛋白表达量相较于对照组水平上调(图3A),而经过p53特异性抑制剂pft-α预处理组的p53表达量有所恢复。以上结果说明MC-LR可促进p53表达增加,这一作用可以被pft-α抑制。

注:不同剂量(2.5～10 nmol/L)MC-LR处理小鼠原代肝细胞48 h;A:彗星实验图;B:头/尾部DNA含量百分比;C:尾力矩;D:8-OHdG浓度;与对照组相比较,*P＜0.05。图2 MC-LR造成的DNA损伤情况Note.Hepatocytes were treated with 2.5～10 nmol/L MC-LR for 48 h.A.Effect of MC-LR on single cell subjected to the indicated treatments.B.Percentage of tail DNA/head DNA.C.Olive tail moment.D.MC-LR treatment resulted in a increase in the 8-OHdG levels.Compared with normal control group,*P＜0.05.Figure 2 Effect of MC-LR on DNA damage

为了进一步验证p53对线粒体功能的影响,该课题选取p53抑制剂pft-α对肝细胞进行预处理,然后使用5 nmol/L MC-LR进行染毒处理,48 h后检测胞内ATP水平和Δψm。研究结果显示(图3B),MC-LR处理组胞内ATP水平为对照组细胞的0.62±0.16倍(P＜0.05),显著性降低,而pft-α预处理组ATP水平为对照组的0.95±0.09倍(P＞0.05)相较于对照组未发生明显波动。另外,通过观察激光共聚焦实验结果图,如图3D所示,相较于MC-LR处理组,pft-α预处理组的红色荧光强度增强,绿色荧光减弱。对聚合物呈现的红色荧光和单体呈现的绿色荧光变化情况进行数据分析,发现pft-α预处理组红色/绿色平均荧光强度比值明显高于MC-LR处理组,但略低于对照组,说明pft-α预处理组Δψm去极化程度低(图3C)。以上结果表明,DNA损伤导致p53水平上调,从而诱发线粒体功能障碍。

注:pft-α预处理小鼠原代肝细胞,加毒素48 h后;A:p53蛋白表达;B:pft-α处理前后的ATP水平;C:JC-1染色,细胞内红/绿平均荧光强度的比值;D:JC-1染色激光共聚焦拍照;与MC-LR处理组相比,*P＜0.05。图3 p53表达及pft-α在线粒体功能损伤中的作用Note.Primary mice hepatocytes were pre-treated with pft-α,and then treated with tox for 48 h.A.Comparison of p53 expression of cells with the indicated treatments.B.ATP levels of either pft-α-preconditioning or without pft-α on mitochondrial function.C.JC-1 stain,the intracellular red/green fluorescence intensity.D.Representative confocal imaging of cells treated with the indicated treatment.Compared with MC-LR group,*P＜0.05.Figure 3 p53 protein level and the role of pft-α in mitochondrial dysfunction

3 讨论

小鼠原代肝细胞暴露于不同浓度的MC-LR毒素中发生了线粒体功能障碍,可能与其诱导的DNA损伤,募集p53表达增加有关。

蓝藻水华向水体释放过量的次生代谢产物——生物毒素,强烈肝毒性的MC-LR毒素通过有机阴离子和胆汁酸的多特异性运输系统进入肝细胞[12],摄入过量的MC-LR造成肝损伤,肝衰竭,严重可诱导肿瘤发生[13-15],受到广泛的毒理学研究。肝实质性细胞是肝的功能型细胞,也是各种因素所致肝损伤的主要靶细胞。该研究在小鼠原代肝细胞基础上进行的,因为原代肝细胞具有体内的肝细胞相似活性,存在完整的转运载体系统[16],并且前期研究中发现原代细胞比细胞株对毒素更加敏感[5],可以更好地还原MC-LR的作用过程,是研究MC-LR对肝影响的理想模型。根据前期的研究,MC-LR(0～100 nmol/L)处理小鼠肝原代肝细胞48 h后,肝细胞存活率百分比曲线呈现明显的剂量-效应依赖型,由曲线计算出MC-LR对小鼠原代肝细胞的IC50值为26 nmol/L。这些数据表明,小鼠原代肝细胞对MC-LR的处理高度敏感,当MC-LR的浓度达到一定水平时产生细胞毒性。该研究实验采用低剂量2.5～10 nmol/L作为MC-LR的研究浓度。

线粒体作为产生ATP的主要基地,满足细胞生长的能量需求,同时参与细胞凋亡、自噬过程,稳定的线粒体膜电位有利于维持细胞正常生理功能[17-18]。一些蛋白组学的研究发现在MC-LR诱导下,线粒体中NADH脱氢酶相关蛋白丰度发生变化,进而影响氧化磷酸化进程[19-20]。另外的报道证明MC-LR能够抑制ATP合酶的功能,导致细胞内能量异常进而促使细胞死亡[21-22]。Majsterek等[23]报道,线粒体的形态学改变是MC-LR导致细胞死亡的主要原因。肝是人体主要代谢器官,线粒体是物质与能量代谢中心,线粒体功能障碍参与肝细胞癌的发生发展过程[24-26],因此研究线粒体功能正常与否具有重要意义。MC-LR进入肝细胞后,线粒体作为易损靶点,迅速受到影响。通过图1结果,发现MC-LR处理的肝细胞内,ATP水平呈浓度依赖性快速下降,膜电位检测探针JC-1染色结果为红色/绿色平均荧光强度比值下降,与激光共聚焦显微镜图像结果一致,说明线粒体膜电位去极化,以此判断MC-LR导致线粒体功能发生障碍。研究报道包括动物体内和体外多种细胞株的试验中,发现MC-LR有确切的基因毒性,比如小鼠体内、人外周血淋巴细胞和人正常肝细胞HL7702细胞株在内的DNA双链发生断裂造成DNA损伤[27-28]。图2结果显示,肝细胞经过MC-LR处理48 h后,损伤标记物8-OHdG增多,影像学图片显示细胞核出现明显的拖尾,作为评估DNA损伤程度的尾力矩也呈毒素浓度依赖性增加,由此可见DNA损伤程度随MC-LR浓度增加而增加。这一结果与过去在动物体内以及不同细胞株中的研究结果一致[29-30]。在机制方面的相关研究中,线粒体功能异常往往被认定为氧化应激损伤造成[31],而越来越多的证据表明线粒体功能障碍和DNA损伤后p53积聚亦有相关性[32-33]。生理情况下,p53维持低浓度稳定存在于细胞质中,当DNA受损时,p53基因迅速被激活,清除减少,高浓度聚集在胞内,一部分p53进入线粒体引发线粒体障碍,触发凋亡[32,34]。为了揭示MC-LR造成线粒体功能障碍的机制,该研究还检测了p53表达情况,Western Blot结果表明MC-LR促使肝细胞DNA损伤后,募集p53,而特异性转录抑制剂pft-α可减弱其敏感性,仍旧维持在低表达状态。p53是机体应对DNA损伤的天然防护屏障,具有双向调节作用,通过修复损伤的DNA使细胞存活,或诱导细胞凋亡消除损伤的细胞维持细胞内稳态,这一选择主要是基于其翻译后修饰调控[35]。该研究为了探究p53在线粒体功能方面的作用,使用pft-α预先处理肝细胞,然后用5 nmol/L MC-LR染毒,48 h后检测线粒体功能,结果发现线粒体中ATP水平回升,Δψm得以恢复到本底70%水平,证明p53可调控线粒体功能。

MC-LR对肝毒性的研究颇多,但是具体的机制仍处于探索阶段。虽然目前发现MC-LR可造成DNA损伤,促进p53基因表达,但鲜有将p53与线粒体功能联系起来。该研究着眼于肝细胞线粒体损伤方面,设计实验检测p53对线粒体功能的影响,试图从线粒体方面揭示MC-LR的毒性作用机制。通过以上实验提示积聚的p53参与线粒体功能调控,但也存在一定的不足之处,比如p53如何影响线粒体功能,是否与线粒体信号通路产生交集,这些值得进一步深入探讨,也是该课题后续研究方向。