miR-148a/Livin轴在肝癌细胞凋亡中的调控作用

赵海清,覃玉梅,汪江波

肝癌是发病率及死亡率均极高的恶性肿瘤[1-2]，其发病与癌细胞异常增殖、凋亡、迁移、侵袭及血管新生等生物学改变有关，阐明疾病的发病机制有助于发现新的疾病诊断、病情评估标志物及新的防治靶点。微小RNA(microRNA，miR)是近些年恶性肿瘤发病机制研究的热点分子，在转录后水平调控癌基因表达并起到促癌或抑癌作用[3-6]。MiR-148a是一种具有抑癌作用的miR，肝癌相关的临床研究证实肝癌中miR-148a表达降低且与TNM分期、微血管侵犯等病理特征恶化有关，也与术后复发率增加有关[7]，提示miR-148a可能参与肝癌的发病，但miR-148a在肝癌发病中的作用缺乏相关细胞实验证据。对卵巢癌一项细胞实验证实miR-148a抑制卵巢癌细胞生长的作用与靶向原癌基因Livin、促进细胞凋亡有关[8]。基于此，本研究将通过细胞实验分析miR-148a/Livin轴在肝癌细胞凋亡中的调控作用，旨在为阐明肝癌发病机制、发现肝癌分子治疗靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、BEL-7402及正常肝细胞株HL-7702为ATCC公司(美国)。

1.1.2 试剂 miR-148a模拟物(序列：5′-UCAGUGCAUCAC-AGAACUUUGU-3′)及阴性对照(negative control，NC)miR为上海吉玛公司(中国)，NC质粒及Livin质粒为上海生工公司(中国)，miR提取、反转录及荧光定量PCR检测试剂盒为上海天根公司(中国)，Livin一抗为Abcam公司(美国)，细胞存活检测试剂盒(MTS法)、双荧光素酶报告基因及检测系统为Promega公司(丹麦)，细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)为上海碧云天公司(中国)。

1.1.3 仪器 倒置显微镜为Nikon公司(美国)，荧光定量PCR仪为ABI公司(美国)，凝胶电泳仪及成像仪为Bio-rad公司(美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、BEL-7402及正常肝细胞株HL-7702在含有10%胎牛血清的培养基中贴壁培养，每2 d更换1次培养基，当贴壁生长的细胞密度达到90%时进行消化传代，传代后的细胞接种在培养皿内用于miR-148a、Livin表达的检测。

为验证miR-148a对细胞凋亡及Livin表达的调控作用，消化得到的HepG2细胞接种在培养板后随机分为miR-NC组和miR-148a组，miR-NC组转染NC miR，miR-148a组转染miR-148a模拟物，连续转染24 h。每组设置5个复孔。

为验证Livin在miR-148a调控细胞凋亡中的作用，消化得到的HepG2细胞接种在培养板后随机分为、miR-NC+NC质粒组、miR-148a+NC质粒组、miR-148a+Livin质粒组，miR-NC+NC质粒组共转染NC miR及NC质粒，miR-148a+NC质粒组共转染miR-148a模拟物及NC质粒，miR-148a+Livin质粒组共转染miR-148a模拟物及Livin质粒，连续转染24 h。每组设置5个复孔。

1.2.2 细胞存活率检测 HepG2细胞接种在96孔板内，分组转染24 h后采用MTS法进行实验，按照试剂盒说明书进行操作，检测实验孔及空白孔490 nm波长的吸光值A490，按照[(实验孔A490-空白孔A490)/(对照孔A490-空白孔A490)×100%]计算存活率。

1.2.3 细胞凋亡率检测 HepG2细胞接种在24孔板内，分组转染24 h后采用TUNEL法进行实验，按照试剂盒说明书进行操作，在显微镜下随机观察5个视野，对视野内TUNEL阳性的细胞数及总细胞数进行计数，按照(TUNEL阳性细胞数/总细胞数)×100%。

1.2.4 miR-148a表达水平的检测 取肝癌细胞株及正常肝细胞株，采用试剂盒进行miR提取、反转录合成cDNA及荧光定量PCR检测。PCR反应体系为cDNA样本1 μL、正向引物和反向引物各0.6 μL、PCR混合液10 μL、去离子水7.8 μL，反应程度为95 ℃ 3 min后95 ℃ 5 s、60 ℃ 15 s重复40个循环。在PCR仪上进行反应并得到循环曲线及循环阈值(Ct)，以U6为内参，按照公式-2ΔΔCt计算miR-148a的表达水平。

1.2.5 Livin表达水平的检测 取肝癌细胞株及正常肝细胞株，加入裂解液提取蛋白，与上样缓冲液混合后煮沸变性，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶内进行western blot实验。电泳分离不同分子量的蛋白，电转移至PVDF膜，孵育Livin一抗(1 ∶1000稀释)、β-actin(1 ∶5000稀释)一抗过夜，次日孵育二抗1 h并在凝胶成像仪中显影得到蛋白条带，计算目的基因Livin蛋白条带灰度值与内参基因β-actin蛋白条带灰度值的比值作为表达水平。

1.2.6 在线生物信息学 在生物信息学分析网站http://www.targetscan.org/vert_72/中输入miR-148a，分析Livin基因mRNA 3′UTR中与miR-148a互补配对的位点。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验 用于实验的HepG2细胞接种在24孔培养板内，将野生型或突变型Livin双荧光素酶报告基因与NC miR或miR-148a模拟物共同转染进入细胞，24 h后采用双荧光素酶报告基因检测系统对细胞内的海肾荧光值及萤火虫荧光值进行检测，参照公式萤火虫荧光值/海肾荧光值计算报告基因的荧光值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。实验数据均为计量资料，miR-148a组与miR5NC组的比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

图1 肝癌细胞株及正常肝细胞株中miR-148a、Livin表达的比较 A：肝癌细胞株及正常肝细胞株中miR-148a表达的比较；B：肝癌细胞株及正常肝细胞株中Livin表达的比较。*与HL-7702细胞比较，P<0.05；#与HepG2细胞比较，P<0.05

2 结果

2.1 肝癌细胞株及正常肝细胞株中miR-148a、Livin表达的比较

肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、BEL-7402及正常肝细胞株HL-7702中miR-148a、Livin表达的比较如图2A-B所示，SMMC-7721、HepG2、BEL-7402细胞中miR-148a的表达水平低于HL-7702细胞(F=7.581、P<0.001)，Livin的表达水平高于HL-7702细胞(F=6.918、P<0.001)，其中HepG2细胞中miR-148a表达下调、Livin表达下调最显著。

图2 miR-NC组与miR-148a组HepG2细胞存活率及凋亡率的比较 A：miR-NC组与miR-148a组HepG2细胞中miR-148a表达的比较；B：miR-NC组与miR-148a组HepG2细胞存活率的比较；C：miR-NC组与miR-148a组HepG2细胞凋亡率的比较(×400)。*与miR-NC组比较，P<0.05

2.2 过表达miR-148a对HepG2细胞存活率及凋亡率的影响

转染miR-148a模拟物的过表达效果如图3A所示，miR-148a组HepG2细胞中miR-148a的表达水平高于miR-NC组(t=6.408、P<0.001)；两组HepG2细胞存活率及凋亡率的比较如图3B-C所示，miR-148a组HepG2细胞的存活率低miR-NC组(t=7.679、P<0.001)，凋亡率高于miR-NC组(t=11.419、P<0.001)。

图3 miR-148a对HepG2细胞中Livin表达的调控作用 A：miR-NC组与miR-148a组HepG2细胞中Livin表达水平的比较；B：miR-148a靶向Livin的生物信息学分析；C：miR-148a靶向Livin的双荧光素酶报告基因实验。*与miR-NC组比较，P<0.05

2.3 过表达miR-148a对HepG2细胞中Livin表达的调控作用

两组HepG2细胞中Livin表达的比较如图4A所示，miR-148a组HepG2细胞中Livin的表达水平低于miR-NC组(t=7.158、P<0.001)；miR-148a靶向Livin的生物信息学分析如图4B所示，Livin基因mRNA 3′UTR含有miR-148a互补配对的结合碱基；miR-148a靶向Livin的双荧光素酶报告基因实验结果如图4C所示，miR-148a组HepG2细胞中野生型Livin报告基因的荧光活力低于miR-NC组(t=8.024、P<0.001)、突变型Livin报告基因的荧光活力与miR-NC组比较无差异(t=0.452、P=0.663)。

图4 过表达Livin对miR-148a调控肝癌细胞存活率及凋亡率的影响 A：NC质粒组与Livin质粒组HepG2细胞中Livin表达水平的比较；B：三组HepG2细胞存活率的比较；C：三组HepG2细胞凋亡率的比较(×400)。△与NC质粒组比较，P<0.05;*与miR-NC+NC质粒组比较，P<0.05；#与miR-148a+NC质粒组比较，P<0.05

2.4 过表达Livin对miR-148a调控肝癌细胞存活率及凋亡率的影响

Livin腺病毒的感染效果如图5A所示，Livin质粒组HepG2细胞中Livin的表达水平高于NC质粒组(t=8.632、P<0.001)；三组HepG2细胞存活率及凋亡率的比较如图5B-C所示，miR-148a+NC质粒组HepG2细胞的存活率低于miR-NC+NC质粒组、凋亡率高于miR-NC+NC质粒组(F=7.623、P<0.001)，miR-148a+Livin质粒组HepG2细胞的存活率高于miR-148a+NC质粒组、凋亡率低于miR-148a+NC质粒组(F=13.746、P<0.001)。

3 讨论

肝癌的恶性程度高、预后差、5年生存率极低[9-13]，目前肝癌的发病机制尚不清楚，临床上也缺乏有效的靶向治疗手段。miRs是一类在转录后水平调节基因表达的长度18-25nt的非编码RNA，在体内分布广泛且生物学作用多样，其在恶性肿瘤中的作用在近些年受到越来越多关注。已有研究证实，多种miRs在肝癌组织及肝癌患者血清中异常表达[14-16]，根据国内周兴芹的临床研究结果，肝癌组织中miR-148a的表达水平明显降低且与病理特征恶化、复发率升高有关[7]。基于以上临床样本的检测结果，本研究将通过细胞实验深入探究miR-148a在肝癌发病中的作用。

本研究对离体培养的3种肝癌细胞株及1种正常肝细胞株中miR-148a的表达进行了检测，与正常肝细胞比较，3种肝癌细胞株中miR-148a的表达均明显降低，与miR-148a在肝癌组织中表达降低的趋势吻合，并且3种肝癌细胞株中HepG2细胞中miR-148a表达下调最显著，后续将在HepG2细胞中研究miR-148a的生物学功能。已有多项研究证实了miR-148a的抑癌作用，过表达miR-148a对胃癌细胞[17]、口腔鳞癌细胞[18]、结直肠癌细胞[19]、食管癌细胞[20]的增殖具有抑制作用、凋亡具有促进作用。本研究在转染模拟物增加HepG2细胞中miR-148a的表达后检测了细胞存活率及凋亡率，结果显示：过表达miR-148a显著降低细胞存活率、降低细胞凋亡率，表明miR-148a促进肝癌细胞的凋亡、在肝癌中发挥抑癌作用。

国内王博[8]在卵巢癌中研究了miR-148a的靶基因，结果显示miR-148a通过靶向抑制原癌基因Livin的表达调控卵巢癌细胞的增殖和凋亡，提示miR-148a的抗癌作用与抑制Livin表达有关。原癌基因Livin的编码产物具有抗凋亡作用，在肝癌[21]、骨肉瘤[22]、卵巢癌[23]、结直肠癌[24]、子宫内膜癌[25]等恶性肿瘤中均呈高表达趋势。本研究对Livin表达的检测显示：三种肝癌细胞株中Livin的表达水平均高于正常肝细胞；并且三种肝癌细胞株中HepG2细胞中Livin表达上调最显著，与HepG2细胞中miR-148a表达下调最显著的结果吻合。以上结果提示提示肝癌发病过程中Livin可能受到miR-148a的调控。

为了验证肝癌细胞中miR-148a对Livin的靶向调控作用及生物学意义，本研究首先在过表达miR-148a后检测到HepG2细胞中Livin的表达水平明显降低；而后经双荧光素酶报告基因验证，过表达miR-148a后野生型Livin报告基因的荧光活力降低，根据在线生物信息学分析结果对miR-148a的结合位点进行突变得到突变型Livin报告基因后、该突变基因的荧光活力不受miR-148a的影响。以上结果表明miR-148a在肝癌细胞中靶向抑制Livin的表达，且靶向位点与在线生物信息学预测一致。在此基础上，本研究在过表达miR-148a的同时通过转染质粒的方式对Livin进行过表达，结果显示过表达Livin使miR-148a降低细胞存活率、增加细胞凋亡率的作用发生逆转，表明miR-148a促进肝癌细胞凋亡的作用与抑制Livin有关。

综上所述，miR-148a通过靶向Livin促进肝癌细胞凋亡，miR-148a/Livin轴在肝癌的发病中起重要作用，未来miR-148a有望成为研究肝癌发病机制及治疗靶点的新分子。本研究未阐明miR-148a在肝癌细胞侵袭、迁移、血管新生中的调控作用，今后应结合生物信息学分析结果、寻找新的miR-148a下游靶基因并探究miR-148a在肝癌发病过程中对癌细胞侵袭、迁移、血管新生的调控作用。