猕猴桃Ac-miR160d启动子区的克隆及表达分析

李哲馨，祝 滢，蒋 娟，决登伟，李洪雷，唐建民，兰建彬

（1.重庆文理学院 园林与生命科学学院/特色植物研究院，重庆 402160； 2.重庆市特色植物产业协同创新中心，重庆 402160；3.重庆市经济植物生物技术重点实验室，重庆 402160）

猕猴桃Actinidia chinensis是我国山区脱贫攻坚的重要产业，然而其果实在采后贮藏过程中极易遭受各类病原菌侵染而变软腐烂，成为阻碍猕猴桃产业发展的重要因素[1]。MicroRNA（miRNA）是一类长度为20 ～24 个核苷酸的非编码RNA，通过与目标基因序列互补实现对靶标的沉默，从而调控生命活动中的一系列重要生物学过程，并被证实参与植物和逆境胁迫的互作[2-4]。研究猕猴桃miRNA 介导的转录调控机制，可为利用miRNA 改良猕猴桃品种、提升果实贮藏保鲜品质提供重要的基因资源。

MiR160 作为miRNA 家族的重要一员，通过靶向生长素响应因子ARFs 参与生长素信号传导途径并发挥调控作用[5]。多项研究结果证实，miR160 参与植物生物胁迫过程。火炬松茎部感染锈病真菌会导致miR160 的表达受到抑制而下调表达[6]。Perez-Quintero 等的研究结果表明，木薯miR160 通过调节生长素信号传导参与对细菌性萎蔫病菌的响应，且调节生长素信号传导可能是抑制植物细菌生长的重要策略[7]。大豆感染烟草花叶病毒后，miR160 被诱导发生明显上调表达[8]。 MiR160 在易感水稻品种中的过表达导致植株对米曲霉的抗病性增强[9]。以上研究结果表明，miR160 参与对真菌病原菌的防御反应。

目前，miR160 已经在拟南芥、苹果、杨树等多种植物中被发现，并被证实参与植物的许多生物学功能[10-13]，但尚不清楚miR160 上游受哪些转录因子的调控。启动子是必需的基因转录起始调控区域，对miRNA 核心启动子和顺式作用元件的鉴定与分析有助于了解miRNA 的活化机制及其在整个调控网络中的重要作用。本研究前期，笔者通过小RNA 测序发现，被灰霉菌Botrytis cinerea侵染后猕猴桃miR160d 被诱导上调表达，推测Ac-miR160d的启动子很可能是逆境诱导型启动子。为给Ac-miR160d 在逆境应答中的功能研究提供参考，本研究中克隆Ac-miR160d 的启动子序列，分析启动子序列中含有的顺式作用元件及转录因子结合域，并对Ac-miR160d 表达受逆境诱导调控进行验证。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以遗传背景清晰的‘红阳’猕猴桃Actinidia chinensiscv.‘Hongyang’的果实作为试验材料。果实采集自重庆文理学院黄瓜山猕猴桃示范基地。因树体上发育果实的不确定因素较多，如病虫害入侵、果实位置、气候条件等，增加了试验结果的不确定性。为尽量避免上述不确定性因素，采集授粉后130 d 约95 g 的猕猴桃果实，并在采后3 h 内运回实验室，使用2%次氯酸钠消毒2 min，再用自来水冲洗2 ～3 次，晾干后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 植物材料的胁迫处理

灰霉菌HFXC-16 菌株分离自感染猕猴桃[14]，提前2周接种到新的PDA培养基上，在25 ℃条件下培养备用。用无菌水稀释菌体，制成104CFU/mL 的菌悬液。将采集的果实随机分成3 组，每个果实用无菌针管扎5 mm 深，造成伤口并晾干后，分别推入10 μL 无菌水、100 mmol/L NaCl 溶液、灰霉菌悬液和40 mg/kg GA3溶液。虽然采摘后的果实可能会发生一定的基因表达的变化，但在进行胁迫处理时设置了对照组试验，miR160d 表达水平的规律性变化可以说明其参与猕猴桃植物激素信号及逆境胁迫的响应。每处理3 次重复，每次重复处理10 个果实，置于光照培养箱中暗培养（温度25 ℃、湿度85%）。侵染0、1、2、3、4、5、6 d 时采集创伤口周围样品，使用液氮迅速冷冻并置于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.2 Ac-miR160d 启动子克隆与RNA 二级结构分析

采用CTAB 法提取猕猴桃基因组DNA。采用TransStart®FastPfuDNA Polymerase 高保真酶（全式金，北京）进行PCR 扩增，反应体系和条件参照说明书。将扩增产物连接至克隆载体pEASY®- Blunt Cloning Kit（全式金，北京）并进行测序验证。所用引物序列（5′—3′）的上游引物为AAACAAATACGCTTTAAGATGTGA，下游引物为GTTTCATGCACATGCACACA。通过在线工具Mfold（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）分析各前体序列的RNA 二级结构。

1.2.3 Ac-miR160d 启动子序列的生物信息学分析

使用Neural Network Promoter Prediction 在线软件（https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）进行核心启动子预测；使用PlantCARE 网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线分析Ac-miR160d 启动子区域可能存在的顺式作用元件；使用PROMO 在线软件（http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）对Ac-miR160d 启动子序列的转录因子结合位点进行预测，设置物种范围为植物。

1.2.4 Ac-miR160d 启动子序列的qRT-PCR 分析

使用RNAiso Plus 试剂盒（Takara，大连）提取总RNA，使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 试剂盒（全式金）合成第一链cDNA，使用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 试剂盒（全式金）进行qRT-PCR 分析。所用引物序列（5′—3′）的上游引物为TGCCTGGCTCCCTGTATGAA，下游引物 为GTGCAGGGTCCGAGGT。 以β-actin作 为内参基因[15]，所用引物序列（5′—3′）的上游引物为GCAGTGTTTCCCAGTATTGT，下游引物为TCCATGTCATCCCAGTTGC。

2 结果与分析

2.1 Ac-miR160d 启动子序列克隆

根据‘ 红阳’ 猕猴桃基因组数据库（http://kiwifruitgenome.org/）、前期本课题组miRNA 及转录组测序结果（已上传至NCBI，PRJNA645761），获取猕猴桃Ac-miR160d 前体序列，该前体序列编号为+1 ～+86 bp，以+1 上游 2 111 bp，+86 下游86 bp 作为Ac-miR160d 的预测启动子，长度为2 283 bp。以猕猴桃果实基因组为模板，采用高保真酶扩增，可获得单一条带，通过测序获得该启动子及前体基因序列（图1）。对Ac-miR160d 前体的RNA 二级结构进行分析，发现其具有典型的小RNA 前体序列结构特征，即具有稳定的茎环折叠的RNA 二级结构以及miR/miR*二聚体结构，且无较大的蛋白编码序列（图2）。

图1 Ac-miR160d 预测启动子克隆Fig.1 Ac-miR160d predicted promoter clone

图2 Ac-miR160d 前体RNA 的二级结构Fig.2 Secondary structure of Ac-miR160d precursor RNA

2.2 Ac-miR160d 启动子核心区域预测

启动子核心区域是保证RNA 聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的DNA 序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游-25 ～-30 bp 处的TATA 盒，其确定转录起始位点并产生基础水平的转录。使用Neural Network Promoter Prediction 在线软件，以预测值0.8 作为判断的截断值，该启动子序列可能存在预测分值分别为1.00、0.91、0.82、0.96、0.84 和0.89 的6 段核心启动子区域，序列分别位 于40 ～90、891 ～941、921 ～971、1 290 ～ 1 340、1 875 ～1 925 及2 060 ～2 110 bp 处，可能转录起始位点分别为C、T、A、A、G、A，分别位于81、932、962、1 331、1 926、2 101 bp 处 （表1）。

表1 Ac-miR160d 启动子核心区域预测结果†Table 1 The prediction result of the core region in Ac-miR160d promoter

2.3 Ac-miR160d 启动子顺式作用元件预测

使用PlantCARE 和PLACE 网站在线分析AcmiR160d 启动子区域可能存在的顺式作用元件，发现该启动子区域不仅存在TATA-box、CAATbox 等基本转录元件，还存在激素应答元件（赤霉素应答元件P-box、水杨酸响应元件TCAelement、脱落酸应答元件ABRE、茉莉酸响应元件CGTCA-motif 等）、参与逆境胁迫的元件（厌氧响应元件ARE、干旱诱导的MYB 结合位点等）以及大量光应答元件（ATCT-motif、G-box、GAmotif、BOX4、GATA-motif、GT1-motif、LAMPelement、MRE、Sp1、chs-CMA2a 等），如图3 所示。

图3 Ac-miR160d 启动子顺式作用元件预测结果Fig.3 Prediction of cis-acting elements in Ac-miR160d promoter sequences

2.4 Ac-miR160d 启动子转录因子结合域预测

使用PROMO 在线软件对Ac-miR160d 启动子序列的转录因子结合位点进行预测，结果发现该启动子区存在PF1、PBF、SQUA、MYB2、HSF1、 GAMYB、SPF1、Dof2、PHR1 等26 种转录因子结合位点（图4）。

图4 Ac-miR160d 启动子转录因子结合域预测结果Fig.4 Prediction of Ac-miR160d promoter transcription factor binding domain

2.5 Ac-miR160d 在胁迫处理条件下的表达分析

根据Ac-miR160d 启动子区顺式作用元件的分析结果，分别对猕猴桃果实进行非生物（NaCl、GA3）和生物（灰霉菌）胁迫处理，并检测AcmiR160d 的水平。结果显示，当猕猴桃果实受到盐胁迫时，在胁迫处理后1 d 时Ac-miR160d 的水平即发生明显下调，胁迫处理后3 ～6 d 时下调更为显著。当猕猴桃果实受到GA3处理和灰霉菌侵染时，Ac-miR160d 的水平出现先升高、后降低的趋势，在侵染处理后1 ～2 d 时急剧升高，随后逐渐降低（图5）。说明Ac-miR160d 参与猕猴桃盐胁迫及其与灰霉菌的互作，且与激素调控密切相关。

图5 Ac-miR160d 在盐胁迫、GA3 处理及灰霉菌侵染下的表达Fig.5 Expression analysis of Ac-miR160d under salt stress, GA3 treatment and B.cinerea infection

3 结论与讨论

本研究中克隆了猕猴桃Ac-miR160d 的启动子序列，并分析了其顺式作用元件及转录因子结合域，结合盐胁迫、GA3处理及灰霉菌侵染后猕猴桃果实内Ac-miR160d 的表达情况，初步验证AcmiR160d 的表达受逆境诱导调控。

有研究结果表明，miRNA 启动子序列中含有TATA-box、CAAT-box、CT repeat 等启动子特征元件[16]。本研究中克隆到的Ac-miR160d 启动子序列中含有相关元件，说明Ac-miR160d 启动子符合RNA 聚合酶Ⅱ指导转录的基因启动子的特征。通过启动子核心区域预测，初步确认猕猴桃Ac-miR160d 启动子序列的转录起始位点在AcmiR160d 上游180 ～1 000 bp 处。

受逆境诱导的miRNA 启动子存在逆境应答相关元件[17]。在对Ac-miR160d 启动子元件进行分析时，发现了一些与激素应答、逆境胁迫、光应答相关的元件。这些元件的存在说明Ac-miR160d极有可能参与对激素信号转导、逆境胁迫和光反应的调控过程。miRNA 的转录由复杂的调控系统调节，外界环境刺激或内源信号可促使不同转录因子与转录调控元件相结合。miRNA 启动子上转录因子结合部位的确定对研究miRNA 的转录调控具有重要意义，可为后续Ac-miR160d 上游互作蛋白筛选及对miR160 抗逆调控网络的挖掘提供参考。本研究中发现Ac-miR160d 启动子区存在大量参与调控逆境胁迫转录因子的结合位点。PBF和Dof2 属于Dof 家族C2H2 锌指因子类，PBF 被证实有助于bZIP 转录因子结合DNA[18]。MYB 和WRKY 是植物转录因子基因家族的2 个大类，参与调控植物对生物和非生物胁迫的双重响应[19-22]。本研究结果表明，在Ac-miR160d 启动子区域有MYB2、GAMYB、MYB305 以及SPF1 结合位点，还有参与高温胁迫响应的HSF1、磷胁迫相关转录因子PHR1 等结合位点，这些结合位点均与胁迫诱导调控相关联。

本研究中分别用无菌水、NaCl 溶液、GA3溶液及灰霉菌悬浮液对猕猴桃果实处理0 ～6 d 后进行qRT-PCR 分析，结果表明miR160d 的表达在猕猴桃果实受盐胁迫、GA3诱导和灰霉菌侵染后迅速作出反应，推测Ac-miR160d 参与调控猕猴桃果实对NaCl 胁迫及灰霉菌的防御响应，且与激素调控密切相关。在灰霉菌侵染后1 ～2 d 时AcmiR160d 的表达明显上调，说明猕猴桃果实通过miR160d 的表达抵抗灰霉菌侵染造成的胁迫；随着胁迫处理后时长的增加，miR160d 的表达有所下调，但在处理后4 d 时有所回升，随后再次下调，推测猕猴桃果实逐渐适应胁迫后miR160d 的表达有所回升，但是由于无法长时间适应，使得miR160d 再次下调。灰霉菌侵染猕猴桃果实后，miR160d 的表达水平明显高于赤霉素处理。这些结果进一步说明Ac-miR160d 启动子为逆境诱导型启动子。

由于本研究中生物信息学分析结果具有一定的局限性，应进行分子生物学及功能的验证。下一步将构建Ac-miR160d 启动子融合GUS基因植物表达载体，利用猕猴桃遗传转化体系[23-24]，在多种胁迫和激素诱导条件下，验证启动子相应顺式作用元件的功能。