蓝莓花粉活力与内源激素和多胺的关联分析

杨 芩，付 燕，陈银艳，刘雅兰，张婷渟，彭 舒，邓 洁

（1.凯里学院 大健康学院，贵州 凯里 556000；2.黔东南民族职业技术学院，贵州 凯里 556000）

花粉的发育与授粉受精是一个复杂而又需多因子协同调控的生命过程，花粉育性与其花药发育期间各种内源激素的变化具有相关性，过低的玉米素（ZT）含量使得花粉母细胞不能分裂形成四分体，而过高的脱落酸（ABA）含量却能促使花粉母细胞退化甚至死亡，进而使花粉育性降低[1]。花粉中的多胺通过调节转录作用、构建花粉细胞壁、调节蛋白组装及调节活性氧的水平来调节花粉囊中糖类、脂类和蛋白等营养和结构物质的含量[2]，花粉囊中的这些物质直接决定着花药内营养物质的积累、分配与花粉的育性[3]，赤霉素（GA3）和玉米素（ZT）的含量低而乙烯含量较高可能会使花粉萌发率降低[4]。花粉囊的绒毡层细胞中游离态吲哚乙酸（IAA）和多胺的大量积累，会促进花粉和柱头的识别及花粉管向胚珠中生长[2,5-6]，而ABA 则会抑制花粉管的生长[7]。在花粉管的生长过程中，乙烯信号在助细胞发挥功能和花粉管吸引中起着至关重要的作用，引导着花粉管向胚囊生长[8]。花粉和雌蕊中的玉米素核苷（ZR）和异戊烯基腺苷（IPA）的含量过低而ABA 的含量过高及（IAA+GA3+ZR+IPA）/ABA 之值过低，则可导致花粉管粗细不均匀、呈结节状、先端膨大、双花粉管及扭曲、折叠等自交不亲和现象[9]，反之则有利于自交亲和[10]。

蓝莓属杜鹃花科Ericaceae 越桔属Vaccinium植物，是一种经济价值极高的新兴小浆果树种[11]， 其商业栽培类型主要为四倍体的北高丛蓝莓和南高丛蓝莓、二倍体和四倍体的矮丛蓝莓及六倍体的兔眼蓝莓[12]，这些栽培类型中的多数品种具有自交不亲和性[13-15]。迄今为止，关于蓝莓自交不亲和性的研究主要集中在亲和性判定的田间授粉试验[13-16]、花粉管动力学研究[17-18]及花粉直感效应鉴定[19-21]等方面，而关于自交不亲和形成机理的研究尚未开展，故对其机理仍不得而知。花粉是自交不亲和性产生的重要因子之一，其功能是产生精子并运载使之进入胚囊中实现双受精，在这一过程中激素扮演着至关重要的角色。然而，目前关于蓝莓花粉中各种内源激素和多胺的含量与花粉活力及花粉中各种内源激素和多胺间的关系的研究尚未见诸报道。为此，本研究以 7 个兔眼蓝莓品种的花粉为试材，对其花粉活力和IAA、GA3、ZT、ABA、腐胺（Put）、精胺（Spm）和尸胺（Cad）的含量进行测定，并对花粉活力与4 种内源激素的含量与比值及3 种多胺化合物的含量之间的关联性进行分析，以期为蓝莓花粉育性、自交不亲和及花粉直感效应形成的生理机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试植株为种植于凯里学院卓越农林人才培养实训基地内7年生的‘芭尔德温’Vaccinium ashei‘Baldwin’‘ 灿 烂’Vaccinium ashei‘Brightwell’‘蒂芙蓝’Vaccinium ashei‘Tifblue’‘顶峰’Vaccinium ashei‘Climax’‘粉蓝’Vaccinium ashei‘Powderblue’‘ 杰 兔’Vaccinium ashei‘Premier’和‘园蓝’Vaccinium ashei‘Gardenblue’这7 个兔眼蓝莓品种生长健壮且无病虫害的植株。于其大蕾期，选取各参试品种植株树冠外围生长健壮的中、长结果枝，只保留大蕾期的花，将其余花疏掉，然后采用100 目的尼龙网对花枝进行套袋处理并挂牌标记，于开花第3 天按照本实验室的方法[16]进行花粉收集合并后，立即用液氮速冻保存以用于激素和多胺含量的测定中。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉活力的测定

按照本实验室的方法[16,22]进行花粉的收集和花粉活力的测定：将2.0 mL 的离心管分别放置于各参试品种参试植株开放第3 天的花的花冠口下方，用镊子碰撞花冠，使花粉落入管内以收集花粉，每个品种每次重复收集30 朵后立即带回实验室。然后，将含有0.5 %的TTC 磷酸缓冲溶液1 mL 加入到2 mL 的离心管中，振荡摇匀得到花粉悬液，于37 ℃的黑暗条件下恒温水浴2 h，取20 μL 的花粉悬液进行制片，在OLYMPUS- BX53 型的显微镜（10 倍×10 倍）下统计花粉活力（即每个视野中红色花粉量占花粉总量的比例）并拍照，每个品种重复观测3 次。

1.2.2 内源激素和多胺化合物的提取

参考彭向永等[23]所用的方法（略有改动）提取花粉中的内源激素：取出已采集并保存备用的各参试品种的花粉，用液氮研磨，取研磨好的样本 0.1 g 加入100 μL 的萃取液（甲醇∶水=8∶2），振荡20 min 后超声提取（40 kHz）5 min，以13 200 r/min 的转速低温离心6 min。取上清液50 μL，加入150 μL 的甲醇，振荡2 min，再以13 200 r/min 的转速低温离心6 min，取上清液50 μL 以待测。

多胺化合物的提取方法为：取研磨后的样本 0.1 g 加入100 μL 的纯水提取，涡旋振荡30 min 后超声提取（40 kHz） 30 min，以13 200 r/min 的转速离心4 min。取上清液50 μL，加入150 μL 的甲醇沉淀蛋白，再以13 200 r/min 的转速离心4 min， 取50 μL 的上清液以待测。

1.2.3 内源激素含量的测定

参照前人所用的方法[23-25]（略有改动），采用高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS，Shimadzu LC20AD - API 3200MD TRAP）测定各个参试品种花粉中IAA、GA3、ABA、ZT 的含量。测定参数具体如下：色谱柱为MSLab C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱温为35 ℃；流速为0.6 mL/min； 流动相A 为有机相，即甲醇（2‰的乙酸铵），流动相B 为水相，即水（2‰的乙酸铵）；进样量为10 μL。质谱条件：离子源为-ESI 电喷雾离子源负离子方式，采用MRM 多反应监测方式扫描，气帘气的压力为68.95 kPa，碰撞气的压力为1750 kPa，喷雾电压为-4 500 V，雾化温度为 450 ℃，雾化气的压力为344.75 kPa，辅助气的压力为344.75 kPa，IAA、GA3、ABA 和ZT 的去族电压分别为-30、-35、-25 和-26 V，射入电压为-10 V，IAA、GA3、ABA 和ZT 的碰撞能量分别为-15、-35、-13 和-26 eV，碰撞室射出电压为 -2.0 V。

1.2.4 多胺化合物含量的测定

多胺化合物含量的测定方法与激素含量的测定方法[23]（略有改动）相同。色谱柱为MSLab 45+AA-C18（100 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为50 ℃，流速为1.0 mL/min，流动相A 为水相，即水（甲酸），流动相B 为有机相，即甲醇（甲酸）；进样量为5 μL；离子源为+ESI 电喷雾离子源正离子，碰撞气的压力为700 kPa，雾化温度为550 ℃， 雾化气的压力为379.21 kPa，辅助气的压力为 379.21 kPa，腐胺、精胺、尸胺的去族电压分别为20、30、15 V，射入电压为10 V，腐胺、精胺和尸胺的碰撞能量分别为10、10、25 eV，碰撞室射出的电压为2.0 V。

1.3 数据分析

采用SPSS 22.0 软件在5%的显著度上对所测数据进行SNK（Student-Newman-Keuls）分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 花粉活力的差异分析

7 个蓝莓品种的花粉活力和花粉中各种内源激素与多胺化合物含量的差异分析结果见表1。由表1 可知，参试的7 个兔眼蓝莓品种的花粉活力存在显著差异。花粉活力最高的品种是‘灿烂’，其花粉活力为88.67%，与‘粉蓝’的花粉活力（88.00%）无显著差异，但两者均显著高于‘园蓝’（78.33%）、‘顶峰’（75.00%）、‘芭尔德温’（70.33%）和‘蒂芙蓝’（69.00%）的花粉活力，‘园蓝’‘顶峰’‘芭尔德温’和‘蒂芙蓝’的花粉活力无显著差异，但这4 个品种的花粉活力均显著高于‘杰兔’的花粉活力（48.00%）。

2.2 花粉中各种内源激素含量的差异分析

表1 表明，在参试的7 个蓝莓品种间，花粉中IAA、GA3、ZT 和ABA 这4 种内源激素的含量均存在显著差异，其IAA、GA3和ZT 含量从高到低的变化趋势及差异显著性均基本一致，而其ABA 的含量从高到低的变化趋势则与其IAA、GA3和ZT 的含量变化趋势相反。花粉中IAA 含量最高的品种是‘灿烂’，其含量为0.535 ng/mg， 其与‘粉蓝’花粉中的IAA 含量（0.533 ng/mg）无显著差异，但两者均显著高于‘园蓝’花粉中的IAA 含量（0.474 ng/mg）；‘顶峰’花粉中的IAA 含量为0.447 ng/mg，其显著低于‘园蓝’花粉中的IAA 含量，却显著高于‘芭尔德温’ （0.422 ng/mg）和‘蒂芙蓝’（0.421 ng/mg）花粉中的IAA 含量，‘芭尔德温’和‘蒂芙蓝’花粉中的IAA 含量无显著差异，但两者均显著高于‘杰兔’花粉中的IAA 含量（0.245 ng/mg）。

表1 7 个兔眼蓝莓品种的花粉活力和花粉中各种内源激素与多胺化合物含量的差异分析结果†Table 1 Difference analysis of pollen viability, contents of endogenous hormones and polyamines in pollen of rabbit-eye blueberry cultivars

在参试的7 个蓝莓品种中，花粉中GA3含量最高的品种为‘灿烂’，其含量为0.996 ng/mg， 其与‘粉蓝’花粉中的GA3含量（0.983 ng/mg）无显著差异，但两者均显著高于‘园蓝’花粉中的GA3含量（0.817 ng/mg）；‘顶峰’花粉中的GA3含量为0.783 ng/mg，其显著低于‘园蓝’花粉中的GA3含量，却显著高于‘蒂芙蓝’ （0.726 ng/mg）和‘芭尔德温’（0.725 ng/mg）花粉中的GA3含量，‘蒂芙蓝’和‘芭尔德温’花粉中的GA3含量无显著差异，但两者均显著高于‘杰兔’花粉中的GA3含量（0.580 ng/mg）。

在参试的7 个蓝莓品种中，花粉中ZT 含量最高的品种分别为‘灿烂’和‘粉蓝’，其ZT 含量均为0.505 ng/mg，均显著高于‘园蓝’花粉中的ZT 含量（0.432 ng/mg）；‘顶峰’花粉中的ZT 含量为0.394 ng/mg，其显著低于‘园蓝’花粉中的ZT 含量，却显著高于‘蒂芙蓝’（0.371 ng/mg） 和‘芭尔德温’（0.369 ng/mg）花粉中的ZT含量，‘蒂芙蓝’和‘芭尔德温’花粉中的ZT 含量无显著差异，但两者均显著高于‘杰兔’花粉中的ZT 含量（0.231 ng/mg）。

在参试的7 个蓝莓品种中，花粉中ABA 含量最高的品种为‘杰兔’，其含量为0.126 ng/mg，其显著高于‘蒂芙蓝’（0.108 ng/mg）和‘芭尔德温’（0.103 ng/mg）花粉中的ABA 含量，‘蒂芙蓝’和‘芭尔德温’花粉中的ABA 含量无显著差异；‘顶峰’花粉中的ABA 含量为0.096 ng/mg，其显著低于‘蒂芙蓝’和‘芭尔德温’花粉中的ABA含量，却显著高于‘园蓝’花粉中的ABA 含量 （0.078 ng/mg），而‘园蓝’花粉中的ABA 含量则显著高于‘灿烂’（0.058 ng/mg）和‘粉蓝’ （0.057 ng/mg）花粉中的ABA 含量。

2.3 花粉中多胺化合物含量的差异分析

由表1 可知，在参试的7 个蓝莓品种间，花粉中多胺化合物的含量差异及其变化趋势比其内源激素的含量差异及其变化均更复杂，在同一品种内Put 的含量远高于Spm 和Cad 的含量；花粉中Put、Spm 和Cad 的含量，在7 个蓝莓品种间的差异及其变化均不一致。在参试的7 个蓝莓品种间，花粉中的Put 含量存在着显著差异；7 个蓝莓品种花粉中的Put 含量从高到低依次为‘灿烂’ （986.22 ng/mL）、‘粉蓝’（914.39 ng/mL）、‘园蓝’（600.53 ng/mL）、‘顶峰’（577.31 ng/mL）、 ‘芭尔德温’（564.28 ng/mL）、‘蒂芙蓝’（459.58 ng/mL）和‘杰兔’（400.53 ng/mL）。 7 个蓝莓品种花粉中Spm 的含量差异及其变化比其Put 的含量差异及其变化均更简单，‘灿烂’花粉中的Spm 含量（97.55 ng/mL）最高且显著高于其他6 个品种的，其他6 个品种花粉中的Spm含量为88.54 ～91.61 ng/mL。‘顶峰’花粉中的Cad 含量（69.41 ng/mL）最高，显著高于其他6 个品种的，‘灿烂’与‘蒂芙蓝’花粉中的Cad含量分别为37.61 和36.19 ng/mL，与‘园蓝’花粉中的Cad 含量（33.81 ng/mL）均无显著差异，但均显著高于‘芭尔德温’花粉中的Cad 含量 （32.24 ng/mL），‘杰兔’花粉中的Cad 含量 （22.00 ng/mL）则显著低于‘芭尔德温’的，‘粉蓝’花粉中的Cad 含量最低，仅为17.21 ng/mL，显著低于其他6 个品种的。

2.4 花粉中各种内源激素比值的差异分析

7 个蓝莓品种花粉中各种内源激素比值的差异分析结果见表2。表2 表明，参试的7 个蓝莓品种花粉中IAA、GA3、ZT 和ABA 这4 种内源激素彼此之间的比值存在着显著差异。各参试品种花粉中的IAA/GA3之值为0.424 ～0.582，‘芭尔德温’‘园蓝’‘蒂芙蓝’‘顶峰’花粉中IAA/GA3之值无显著差异，其比值分别为0.582、0.580、0.580、0.570，这4 个品种花粉中IAA/GA3之值均显著高于‘粉蓝’（0.543）和‘灿烂’（0.537）的， ‘杰兔’花粉中IAA/GA3之值（0.424）最低，显著低于其他6 个品种的。‘芭尔德温’‘蒂芙蓝’‘顶峰’花粉中IAA/ZT 之值分别为1.146、1.134、1.133，且各品种彼此间无显著差异，其与‘园蓝’花粉中IAA/ZT 之值（1.099）亦均无显著差异，却均显著高于‘杰兔’（1.065）、‘灿烂’（1.059）和‘粉蓝’（1.056）的比值。‘园蓝’‘粉蓝’‘蒂芙蓝’‘芭尔德温’‘灿烂’‘顶峰’这6 个品种花粉中ZT/GA3之值为0.504 ～0.529，这6 个品种彼此间的ZT/GA3之值无显著差异，但其比值均显著高于‘杰兔’花粉中ZT/GA3之值（0.398）。

表2 7 个兔眼蓝莓品种花粉中各种内源激素比值的差异分析结果Table 2 Difference analysis of the ratio of endogenous hormones in pollen of rabbit-eye blueberry cultivars

参试的7 个蓝莓品种花粉中ABA/IAA、 ABA/GA3、ABA/ZT、ABA/(IAA+GA3+ZT)之值 与IAA/GA3、IAA/ZT、ZT/GA3之值的差异趋势不一致。7个蓝莓品种花粉中ABA与IAA的比值，‘杰兔’的比值（0.515）最高，显著高于其他6 个 品种的，且至少是其他6 个品种的2 倍；‘蒂芙蓝’与‘芭尔德温’的比值分别为0.257 和0.245，显著高于‘顶峰’的比值（0.214）；‘粉蓝’与‘灿烂’花粉中的ABA/IAA 之值都较低，分别为0.108 和01.09，均显著低于其他5 个品种的。7 个蓝莓品种花粉中ABA/GA3和ABA/ZT 之值的差异变化规律与其ABA/IAA 之值的差异变化规律均一致：‘杰兔’花粉中ABA/GA3与ABA/ZT 之值均较高，分别为0.217 和0.545，且均显著高于 其它6 个品种花粉中ABA/GA3和ABA/ZT 之值；‘粉蓝’与‘灿烂’花粉中的ABA/GA3之值分别为0.058 和0.059，其ABA/ZT 之值分别为0.113与0.115，均显著低于其他5 个品种的两个比值。 7 个蓝莓品种花粉中的ABA/(IAA+GA3+ZT)、ABA/IAA、ABA/GA3、ABA/ZT 之值的差异趋势保持一致。‘杰兔’花粉中的ABA/(IAA+GA3+ZT) 之值（0.119）最高，且显著高于其他6 个品种的这个比值；‘粉蓝’与‘灿烂’花粉中的ABA/(IAA+ GA3+ZT)之值最低，分别为0.028 和0.029，且均显著低于其他5 个品种的这个比值。

2.5 花粉活力与各种内源激素的含量和比值及多胺含量间的相关性分析

参试的7 个蓝莓品种的花粉活力与花粉中IAA、GA3、ZT 和ABA 这4 种激素的含量及其比值和Put、Spm 和Cad 这3 种多胺化合物的含量之间有着不同程度的相关性，分析结果见表3。表3表明，花粉活力与花粉中IAA、GA3与ZT 的含量间均呈极显著正相关，其相关系数分别为0.958、0.938 和0.964；而与ABA 的含量呈极显著负相关，其相关系数为-0.902。花粉活力与花粉中IAA/GA3与ZT/GA3之值均呈显著正相关，其相关系数分别为0.565 和0.760；而与IAA/ZT 之值的相关系数（-0.193）较低且未达到显著水平。花粉活力与花粉中ABA/IAA、ABA/GA3、ABA/ZT、ABA/(IAA+GA3+ZT)之值均呈极显著负相关，其相关系数分别为-0.946、-0.956、-0.956、-0.960。花粉活力与花粉中Put、Spm 和Cad 含量的相关性不一致：花粉活力与Cad 含量呈极显著正相关，其相关系数为0.842；而与Spm 含量呈显著正相关，其相关系数为0.606；其与Put 含量的相关性未达到显著水平，其相关系数仅有0.111。

表3 花粉活力与各种内源激素的含量及其比值和多胺含量间的相关性分析结果†Table 3 The correlation between the pollen viability and content of endogenous hormones and their ratios, and content of polyamine in rabbit-eye blueberry

3 结论与讨论

植物激素是指植物通过自身代谢产生的、在很低浓度下就能产生明显生理效应的一些有机信号分子[26]，显花植物花芽的分化和形成是多种激素以一定比例在时间和空间的多维度调控的结果[24]， 内源激素直接或间接地调控着花粉的发育、萌发、花粉管生长和授粉受精过程[9]。研究结果表明，‘杰兔’的花粉活力仅为48.00%，显著低于‘灿烂’（88.67%）、‘粉蓝’（88.00%）、‘园蓝’（78.33%）、‘顶峰’（75.00%）、‘芭尔德温’（70.33%）和‘蒂芙蓝’（69.00%）的花粉活力，并且‘杰兔’花粉中IAA、GA3、ZT 这3 种激素和Put、Spm、Cad 这3 种多胺化合物的含量均分别显著低于‘灿烂’‘粉蓝’‘园蓝’‘顶峰’‘芭尔德温’和‘蒂芙蓝’6 个品种花粉中相同3 种激素和3 种多胺化合物的含量，而‘杰兔’花粉中的ABA 含量却显著高于‘灿烂’‘粉蓝’‘园蓝’‘顶峰’‘芭尔德温’和‘蒂芙蓝’6 个品种花粉中的ABA 含量。‘杰兔’花粉中含量过低的GA3、ZT 和含量高的ABA 可能影响了花粉中内源物质和能量的正常代谢，进而使其花粉母细胞分裂受阻不能形成四分体，过高的ABA 则可能促进花粉母细胞的退化甚至死亡[1,27-28]，低含量的多胺化合物通过调节蛋白组装和活性氧的水平，影响了花粉细胞壁的构 建[2]，进而使其雄性器官发育不完全，出现了花药畸形或空瘪、花粉量减少[22]和花粉活力降低的现象。同时，低含量的GA3和ZT 亦可能导致了‘杰兔’花粉萌发率的降低[4]，低含量的IAA 和多胺化合物及高含量的ABA 则可能抑制了其花粉和柱头的识别和花粉管的生长，诱导其自交不亲和性的增强，导致了‘杰兔’自交育性的降低[2,5-7,9]。

此外，内源激素在植物组织中普遍存在，各种激素发挥的调控作用都有着其特定的适宜浓度范围，且每种激素都不是孤立存在的，植物的生长发育不仅受激素含量的影响，更受激素间的相互协作或相互拮抗的共同调控[2,9]。因此，植物的花粉发育和授粉受精过程主要受促进生长类激素与抑制生长类激素的平衡调控[9]。研究中发现，花粉活力最低的‘杰兔’其花粉中ABA/IAA、ABA/GA3、ABA/ZT、ABA/(IAA+GA3+ZT)之值均显著高于花粉活力最高的‘粉蓝’和‘灿烂’花粉中对应的几个比值；且相关性分析结果表明，花粉活力与这4 个比值均呈极显著负相关，这与前人有关百合[27]、四倍体黑皮冬瓜[9]和西瓜雄性不育系[29]的研究结果类似。ABA/ZT 和ABA/GA3之值相对高可能是‘杰兔’的小孢子发育受阻[27]，表型为雄性器官发育不全、花药空瘪、花粉量减少和花粉活力降低的主要原因[22]。ABA/(IAA+GA3+ZT)之值相对高则可能使得‘杰兔’花粉中有限的生长类激素在与ABA 的作用相抵后所产生的促进生长的效应十分有限，其对花粉萌发、花粉管生长的促进作用甚微，则可能会导致花粉管粗细不均匀、结节状、先端膨大、双花粉管及扭曲、折叠等自交不亲和现象的出现[9]，进而影响其授粉受精效应，导致花粉直感效应的形成[19,21]。

综上所述，兔眼蓝莓花粉活力与花粉中IAA、GA3、ZT 和ABA 这4 种内源激素的含量密切相关，可以推测，低水平的GA3和ZT导致‘杰兔’雄性器官部分受阻，使其花粉量减少和花粉活力降低，低含量的IAA 与多胺化合物和高含量的ABA 及相对高的ABA/(IAA+GA3+ZT)之值则可能抑制了花粉和柱头的识别、花粉的萌发和花粉管的生长，表现出自交不亲和性及花粉直感效应。此研究结果为弄清兔眼蓝莓花粉活力与内源激素间的关系及花粉直感效应形成的生理机制奠定了一定的理论基础。但是，内源激素调控植物生长发育的作用是其在植物组织内一定空间和时间的多维度调控的结果。本研究仅对比分析了开花第 3 天各参试品种的花粉活力、多胺化合物的含量、内源激素的含量和比值的差异情况，重点研究的是成熟花粉的一种状态，而缺乏对花粉发育过程中各种内源激素和多胺化合物的动态变化特征及其对授粉受精影响的全面而又深入的研究。因此，以花粉发育和授粉受精生命过程为线索，研究蓝莓花粉发育、授粉受精和果实发育过程中内源激素的动态变化特征，这应成为今后关于蓝莓花粉败育和花粉直感效应形成生理机制研究的重点。