急性心肌梗死患者血清GRP78、mir-335表达与心功能关系

刘晨，程国杰，甘榕榕

急性心肌梗死（AMI）严重威胁人们生命健康，早期诊断对降低死亡率以及改善预后十分重要[1,2]，生物标志物与心电图相结合是诊断AMI的主要手段，目前生物标志物肌钙蛋白I（cTnI）常出现假阳性结果，因此寻找更敏感的生物标志物至关重要[3,4]。大量研究发现，微小RNA（miRNA）在心血管疾病中具有调节及诊断潜力，可能与其能够结合靶基因3'-UTR区调节基因表达有关[5]。mir-335作为一种miRNA，其表达上调可能显著抑制心肌梗死大鼠心肌炎症及心肌细胞凋亡，改善心肌损伤[6]。心肌细胞死亡是由心肌梗死（MI）造成的最严重损害之一，关于葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的最新研究发现，心肌梗死后心力衰竭（心衰）的大鼠模型GRP78蛋白表达增加，并参与疾病的发生[2]。目前关于二者在AMI中的研究多为细胞及动物实验，相关临床研究较少，本文通过对AMI患者血清GRP78和mir-335表达与心功能关系进行探究，以期为AMI早期诊断生物标志物寻找方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象共纳入207例患者，选取2018年1月至2020年4月于首都医科大学大兴教学医院心内科确诊为AMI患者102例作为AMI组，其中男性55例，女性47例，平均年龄57.32±7.98岁；稳定型心绞痛（SAP）患者105例为SAP组，其中男性44例，女性37例，平均年龄56.79±6.90岁。纳入标准：临床资料完整；无合并甲亢等代谢性疾病；初次确诊，符合美国心脏病协会（AHA）所制定的AMI及SAP诊断标准[7]。排除标准：恶性肿瘤患者；冠状动脉（冠脉）支架植入术及旁路手术史患者；免疫系统疾病患者。本研究经我院伦理委员会批准，受试者及家属均知情并签署同意书。

1.2 主要试剂与仪器反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（货号：BTN170403-RFS、BTN90408-YNZ）购自北京百奥莱博科技有限公司；总RNA提取试剂盒（货号：CD-13433-ML）购自武汉纯度生物科技有限公司；脑钠肽（BNP）ELISA检测试剂盒（货号：CBLE1347h）购自武汉楚锐科药业科技有限公司；GRP78（货号：YS02906B）购自上海雅吉生物科技有限公司；CFX384™ Touch荧光定量PCR系统购自伯乐（Bio-Rad）公司；AU5800全自动分析系统购自美国贝克曼库尔特有限公司；SPRT2100C全自动酶标仪购自德国IFP公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及检测两组患者于入院次日抽取空腹静脉血4 ml，10 min 3000 rpm离心后取上清，置于-20℃冰箱待测；2 ml用于ELISA法检测肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、cTnI、BNP及GRP78水平；2 ml用于检测mir-335表达情况。

1.3.2 超声心动图检查两组患者在入院12 h内均行超声心动图，测量左室射血分数（LVEF）。

1.3.3 ELISA法检测各因子水平根据检测试剂盒说明书检测在450 nm处检测两组患者血清中CKMB、cTnI、BNP及GRP78的表达情况。

1.3.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测mir-335表达情况RNA提取试剂盒各血清样本总RNA后反转录为cDNA，以其为模板经过qRTPCR检测mir-335在各组血清中的表达情况。U6分别作为mir-335的内参对mRNA进行标准化，2-△△Ct分析其表达水平，Oligo 7和Primer 3.0软件设计如表1所示，引物并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。

表1 引物序列

1.4 统计学方法计量资料用均数±标准差（±s）进行描述，SPSS 23.0统计学软件进行分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以例表示，采用卡方检验；mir-335及GRP78表达与CK-MB、cTnI、BNP及LVEF间相关性采用Pearson相关系数法进行分析；受试者工作特征（ROC）曲线评估mir-335及GRP78表达水平对AMI的诊断价值；使用Logistic回归分析影响AMI发生的因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较两组在患者年龄、体质指数、性别、高血压、冠心病、糖尿病史间均无显著性差异（P＞0.05），表2。

表2 受试患者的一般资料

2.2 两组CK-MB、cTnI、BNP及LVEF比较与SAP组比较，AMI组患者血清中CK-MB、cTnI、BNP含量显著增加，LVEF含量显著降低（P＜0.05），表3。

表3 SAP和AMI组血清中CK-MB、cTnI、BNP含量及LVEF

2.3 两组GRP78和mir-335 mRNA的表达情况与SAP组比较，AMI组患者血清中GRP78表达水平显著增加，而mir-335表达水平显著降低（P＜0.05），表4。

表4 SAP组和AMI组血清中GRP78和mir-335 mRNA表达情况

2.4 AMI组血清中GRP78和mir-335与CK-MB、cTnI、BNP及LVEF的相关性AMI组患者血清中GRP78与CK-MB、cTnI、BNP均呈显著正相关关系，与LVEF呈显著负相关；mir-335与CK-MB、cTnI、BNP均呈显著负相关，与LVEF呈显著正相关关系，表5。

表5 AMI组血清中GRP78和mir-335与CK-MB、cTnI、BNP及LVEF的相关性

2.5 AMI组血清中GRP78和mir-335的相关性通过http://www.targetscan.org/vert_72/预测显示GRP78和mir-335间存在结合位点，GRP78是mir-335的潜在靶基因。如图1所示，AMI组患者血清中GRP78与mir-335呈显著负相关（r=-0.732，P=0.000）。

图1 AMI组血清中GRP78和mir-335的相关性

2.6 ROC曲线分析GRP78和mir-335对AMI的诊断价值如图2所示，GRP78和mir-335评估AMI发生的曲线下面积（AUC）分别为0.897和0.722，截断值：1.778、1.183；灵敏度：76.47%、52.00%；特异性：98.10%、91.40%；二者联合检测评估AMI发生的AUC为0.924，灵敏度：80.40%；特异性：97.10%。

图2 ROC曲线分析GRP78和mir-335对AMI的诊断价值

2.7 Logistic回归分析影响AMI发生的因素AMI患者GRP78和mir-335表达水平的中位数分别为1.313和0.872，高于中位数为高表达，低于中位数为低表达，对二者表达进行Logistic回归分析发现GRP78及mir-335表达均对AMI发生存在影响（P＜0.05）。多因素分析发现，GRP78高表达及mir-335低表达均是影响AMI发生的独立危险因素（P＜0.05），表6。

表6 Logistic回归分析影响AMI发生的因素

3 讨论

AMI是由斑块溃疡或血管内血栓形成、破裂后所释放的血栓物质引发的急性冠脉综合征引起的全球最常见的心脏疾病，严重影响患者生活质量及生命健康[8]。虽然AMI诊断金标准cTn有助于疾病诊断，但对于慢性冠脉疾病常出现假阳性结果，因此寻找新型敏感性早期诊断生物标志物对临床治疗极为重要[9]。

mir-335-5p与心力衰竭的左心室重塑（LVR）有关[10]。mir-335表达水平在MI区域明显降低，其过表达可通过靶向抑制促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶2（MAP3K2）表达来降低氧化应激、心肌细胞凋亡、炎症损伤，从而达到改善MI大鼠心功能的作用[6]。研究发现，mir-335的上调可通过靶向低氧诱导因子1-α亚基抑制剂（HIF1AN）改善心肌缺血再灌注损伤（MIRI）[11]。本研究发现AMI患者血清中CK-MB、cTnI、BNP含量显著增加，而LVEF含量和mir-335表达水平显著降低，且mir-335与CK-MB、cTnI、BNP均呈显著负相关，而与LVEF呈显著正相关关系，与之前研究结果一致。该结果表明mir-335参与AMI的发生，且与心肌损伤标志物及心功能指标密切相关，有作为疾病早期检测生物标志物的潜能。

大量研究表明内质网应激（ERS）参与缺血再灌注损伤的发生，而GRP78是ERS相关途径中的关键因子[12,13]。研究发现MI模型大鼠心肌组织中GRP78表达水平显著增加，前列腺素E1（PGE1）可抑制ERS且伴随GRP78表达下降，抑制炎症反应、胶原增生并改善心功能[14]。本研究发现AMI患者血清中GRP78表达水平显著高于SAP组，与CKMB、cTnI、BNP均呈显著正相关关系，与LVEF呈显著负相关关系；该结果表明GRP78可能参与AMI的发生，且与CK-MB、cTnI、BNP及LVEF密切相关，具有一定临床参考价值。

本研究靶基因预测结果显示GRP78是mir-335的潜在靶基因，二者呈显著负相关关系，且二者联合评估AMI的灵敏度更高；此外，多因素分析发现，GRP78高表达及mir-335低表达均是影响AMI发生的独立危险因素。结果表明，mir-335参与AMI的发生可能与其负调控GRP78有关，二者联合评估AMI的诊断价值更高，可作为AMI早期诊断标志物。

综上所述，AMI患者血清中GRP78和mir-335表达水平与心功能密切相关，二者有作为疾病早期诊断指标的潜能。因样本量限制，可能存在统计学差异，今后研究中应继续扩大样本量验证。