喜炎平注射液对ARDS患者血清炎性因子和全血苦味受体水平的作用及机制*

汤娜娜，谢登海，杨国辉，宁睿，刘晓娴，方昊，李莉，刘婷

(1.贵州医科大学附属医院 内科ICU，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院 心内科，贵州 贵阳 550004)

喜炎平注射液是由穿心莲内酯总磺化物制成的现代中药注射液，具有抗病毒、抗菌及抗炎等作用，被广泛用于呼吸系统感染性和炎症性疾病的临床治疗[1-2]。苦味受体(bitter taste receptors，TAS2R)是与人体感受苦味物质密切相关的一类G蛋白偶联受体，在全身多个组织器官中均有表达[3]，近年发现TAS2R在呼吸系统的防御机制中发挥重要作用[4-5]。本课题组前期生物学研究表明，TAS2R亚型TAS2R39是脓毒症并发急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的关键基因之一，提示TAS2R及其信号通路可能在ARDS发生机制中发挥重要作用[6]。穿心莲属苦味类中药[7]，喜炎平注射液可否通过调节TAS2R的表达、在治疗ARDS中发挥抗炎效应尚无研究报道。本研究通过观察喜炎平注射液对ARDS 患者炎症反应的影响，并对其作用机制进行初步探讨，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2020年7月—2021年6月收治的ARDS患者，要求符合“ARDS柏林定义”诊断标准[8]，治疗前ARDS分型为轻度或中度[氧合指数(the ratio of arterial blood partial pressure of oxygen to the fraction of inspired oxygen，PaO2/FiO2)为100 mmHg<～≤300 mmHg]、呼吸末正压≥5 cm H2O、年龄为18～75岁，患者本人或授权委托人同意并签署知情同意书；排除已知或怀疑对喜炎平注射液或相关成分过敏者，排除妊娠期和哺乳期女性患者，排除有免疫功能缺陷(如长期使用糖皮质激素或免疫抑制剂，恶性肿瘤等)，排除有严重肝肾功能异常，排除放弃积极抢救、不愿进行常规治疗者。共纳入ARDS患者49例，采用随机数字表法，将患者分为对照组(n=25)和观察组(n=24)，2组患者的临床特征见表1。本研究获得医院伦理委员会批准实施[2020伦审第(268-01)号]。

1.2 研究方法

1.2.1治疗方法 对照组ARDS患者接受ARDS常规治疗，包括病因治疗、机械通气、抗感染及营养支持治疗等；观察组ARDS患者在对照组常规治疗基础上联合喜炎平注射液治疗，治疗方案为喜炎平注射液(江西青峰药业有限公司，国药准字Z20026249)250 mg加0.9%氯化钠注射液250 mL稀释，静脉滴注，1次/d，疗程7 d。

1.2.2基本资料和临床指标收集 收集2组患者治疗前的基本资料，包括性别、年龄、病因分类(肺内源性/肺外源性)、PaO2/FiO2及急性生理与慢性健康状况评分(acute physiology and chronic health evaluation scoring system Ⅱ，APACHE Ⅱ)，记录2组患者治疗过程中药物不良反应发生情况(包括皮疹、过敏性休克及严重肝肾功能不全等)以及治疗后的PaO2/FiO2。

1.2.3血清炎性因子检测 分别于治疗前及治疗结束时抽取2组患者外周静脉血标本，3 000 r/min离心10 min，取上清，采用电化学发光法和免疫比浊法分别检测2组患者血清白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和C反应蛋白(C-reaction protein，CRP)水平，操作严格按说明书执行，IL-6和CRP试剂盒均购自美国Roche。

1.2.4全血TAS2R39 mRNA检测 分别于治疗前及治疗结束时抽取2组患者外周全血标本2 mL，采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR)检测TAS2R39 mRNA的表达；全血标本离心柱吸附法提取总核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，分光光度计检测总RNA纯度和浓度；采用SYBR Green 染色法进行RT-qPCR扩增，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参，健康志愿者全血RNA样本作为空白对照，通过2-ΔΔCt公式计算TAS2R39 mRNA的相对表达量；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成，TAS2R39上游引物为5′-TGATACCCTGGCTTCTGT-3′、下游引物为5′-TTAGTGGAGTTGGAGGAGTG-3′，GAPDH上游引物为5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′、下游引物为5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 基本资料

2组患者性别、年龄、病因分类、治疗前PaO2/FiO2及APACHE II评分比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，提示2组患者基本资料具有可比性。见表1。

表1 对照组和观察组患者的基本资料

2.2 治疗后PaO2 /FiO2水平及并发症

2组患者在治疗过程中均未发生皮疹、过敏性休克及严重肝肾功能不全等药物不良反应；治疗后，观察组患者的PaO2/FiO2[244.5(190.0，261.5)mmHg]较对照组[225.0(154.0，245.0)mmHg]升高，差异有统计学意义(Z=-2.17，P=0.03)。

2.3 血清 IL-6和CRP水平

治疗前2组患者血清 IL-6、CRP水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后2组患者血清IL-6、CRP均较治疗前下降(P<0.05)，且观察组较对照组的水平更低(P<0.05)。见表2。

表2 对照组和观察组患者血清IL-6和CRP水平比较[M(P25,P75)]

2.4 全血TAS2R39 mRNA

治疗前2组患者全血TAS2R39 mRNA水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；对照组患者治疗后全血TAS2R39 mRNA水平与治疗前比较，差异无统计学意义(P>0.05)；观察组患者治疗后全血TAS2R39 mRNA水平较治疗前明显升高，且高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图1。

注：(1)与同组治疗前比较，P<0.01；(2)与同时点对照组比较，P<0.01。

2.5 TAS2R39 mRNA水平与炎性因子的相关性

Spearman相关分析表明，观察组患者治疗后TAS2R39 mRNA的表达分别与 IL-6(rs=-0.728,P<0.001)和CRP(rs=-0.622，P<0.001)水平呈负相关；对照组患者治疗后全血TAS2R39 mRNA的表达与炎性因子IL-6(rs=0.166,P=0.429)和CRP(rs=0.100,P=0.633)的水平无秩相关。

3 讨论

ARDS是一种临床常见的急危重症，是由于炎症反应失控造成的急性弥漫性肺损伤，多种肺内、肺外原因均可诱发ARDS，最常见的病因为细菌性或病毒性肺炎[9]。例如目前全球疫情依然严峻的新冠肺炎，重症患者机体可出现过度的炎症反应即“细胞因子风暴”，引起ARDS等严重并发症，导致患者病情恶化甚至死亡[10-11]。我国在此次抗击新冠肺炎疫情中取得了重大战略成果，中西医结合治疗起到重要作用。在多版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中，喜炎平注射液被推荐用于治疗重型新冠肺炎患者[12-14]。既往研究表明，喜炎平注射液有多种抗炎机制，如抑制核转录因子-κB/丝裂原活化蛋白激酶(nuclear transcription factor-κB/mitogen activated protein kinase，NF-κB/MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)及Janus激酶/转录激活因子(the Janus kinase/signal transducer of activators of transcription，JAK/STAT)等多条信号通路[15-16]；抑制多种细胞多种促炎基因的表达，包括环氧合酶-2(cyclooxygenase，COX-2)、IL-6、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[17]；减少氧化应激和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)及内皮素-1(endothelin-1，ET-1)等的生成[7,18-20]。目前有关喜炎平注射液治疗ARDS的研究报道少见，在本研究中，观察组ARDS患者联合使用喜炎平注射液治疗期间未发生明显药物不良反应，治疗后血清炎性因子IL-6和CRP水平低于对照组、PaO2/FiO2高于对照组，这一结果提示联合喜炎平注射液治疗ARDS，临床安全性好，能有效改善患者氧合，其机制可能与抑制炎性反应有关。

TAS2R属于G蛋白偶联受体，是味觉受体家族成员，人类基因组共编码25种TAS2R亚型[3]。过去认为TAS2R只存在于口腔味蕾，仅与苦味识别相关，近年发现在呼吸、循环、免疫、消化、中枢神经及生殖等多种系统和组织中均有TAS2R表达，并且发挥不同的生物学功能[21]；呼吸系统气道上皮细胞的TAS2R能增加气道纤毛搏动频率，并可作为前哨受体检测入侵的革兰氏阴性菌，触发防御性杀菌反应[22]；TAS2R可减少依赖免疫球蛋白(immunoglobulinE，IgE)活化的肥大细胞释放组胺和前列腺素D2，抑制肺巨噬细胞释放炎性因子[23]；激活TAS2R及其下游信号通路，可舒张气道平滑肌，作用强于β2受体激动剂[4]。因此，通过多种防御功能，TAS2R有望成为慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等气道炎症性疾病新的防治靶点，但TAS2R及其信号通路是否也与ARDS的发生发展相关，目前少有研究报道。本课题组前期生物信息学研究结果表明，TAS2R39可能在ARDS发生机制中发挥重要作用[24]。此外，已有研究认为苦味中药可经TAS2R途径遏制气道炎症过程[25]。喜炎平注射液属于苦味中药，为研究喜炎平注射液能否通过TAS2R在治疗ARDS中发挥抗炎作用，本研究检测了2组患者治疗前、后全血TAS2R39 mRNA表达，结果显示对照组ARDS患者治疗前、后全血TAS2R39 mRNA的表达水平无差异，但观察组ARDS患者经喜炎平注射液联合治疗后全血TAS2R39 mRNA表达上调且与IL-6、CRP水平均呈负相关，此外这2种炎性因子水平较治疗前及对照组治疗后的水平均有降低，提示喜炎平注射液可能通过上调TAS2R39表达发挥抗炎效应。

综上所述，喜炎平注射液能改善ARDS患者的氧合功能，其机制可能是通过激活TAS2R途径来抑制炎症反应，故本研究结果可为喜炎平注射液辅助治疗ARDS的临床应用提供依据。但本研究尚存不足，如样本量偏少，未纳入重度ARDS患者，只检测了全血标本TAS2R39 mRNA表达，故后续还需扩大样本进一步深入研究。