滋阴通络方对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢及骨密度的影响

孙 凯 陈荣彬 杨英东 李 勇

1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510405；2.广东省中医院珠海医院骨三科，广东珠海 519000

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指绝经后女性雌激素水平下降导致骨脆性增加的一种代谢性骨病[1]，其患病率在>50 岁女性人群中高达67.30%[2]。该病导致了骨折危险性迅速上升，给个人及社会带来了严重的精神、经济负担[3]。目前西药能有效缓解绝经后骨量丢失，但长期使用不仅费用昂贵，而且并发症多[4]。而中医药治疗作为一种经济有效的疗法，在治疗该病方面前景广阔[5]。滋阴通络方是广东省中医药珠海医院用于治疗PMOP 的经验方，具有补益肝肾、滋阴活血通络之效，前期研究证实滋阴通络方联合西药可有效抑制骨吸收，改善骨代谢[6]，提高骨密度[7]。本研究旨在探讨滋阴通络方对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢及骨密度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF 级3 月龄雌性SD 大鼠60 只，体重200～230 g，购自南方医科大学动物科技发展有限公司，并在广东省中医院大学城实验动物中心饲养，生产许可证号：SCXK（粤）2016-0041，使用许可证号：SYXK（粤）2018-0094，合格证号：44002100022874。广东省中医院大学城动物试验中心伦理委员会审查批号：2019044。

1.1.2 药物 滋阴通络方：熟地10 g、麦冬10 g、牛膝10 g、女贞子10 g、当归10 g、白芍10 g、蜈蚣2 条、桑寄生15 g、黄芪10 g、乌梢蛇10 g、防风10 g、鸡血藤15 g、白术10 g、甘草3 g（江阴天江药业有限公司生产，颗粒剂）。阿仑膦酸钠片（海南全星制药有限公司生产，H20150109）；阿法骨化醇软胶囊[广州白云山星野（药业）股份有限公司生产，H20100159]。

1.1.3 主要试剂及设备 Ⅰ前胶原氨基端原肽（procollagen ⅠN-terminal propeptide，PⅠNP）检测试剂盒（H-285）、Ⅰ型胶原氨基末端端肽（N-terminal telopeptide of type Ⅰcollagen，NTX）检测试剂盒（H368-1）、Ⅰ型胶原C 末端肽（C-telopeptide of type Ⅰcollagen，CTX-Ⅰ）检测试剂盒（H-287）（均来源于南京建成生物工程研究所）；micro-CT 仪：比利时生产，型号：Bruker skyscan 1172，扫描参数：电流为88 μA，电压为80 kV，分辨率为9 μm，单次扫描时间为54 min。

1.2 研究方法

1.2.1 模型制备及干预方法 将50 只大鼠利用随机数字表法分为模型组，西药组，滋阴通络方低、中、高剂量组，每组10 只。另取10 只大鼠作为假手术组。所有大鼠在3 ml/kg 水合氯醛全身麻醉下进行绝经后骨质疏松造模。其中假手术组仅摘除卵巢附近脂肪，保留卵巢，其他组均进行双侧卵巢摘除。术后所有大鼠肌注青霉素+0.9%氯化钠溶液（4 万U/ml）抗感染，每天注射1.5 ml，连续3 d。所有去卵巢大鼠每日进行阴道上皮细胞涂片分析，连续5 d 观察到白细胞证明卵巢摘除成功[8]。造模12 周后，六组大鼠均予灌胃操作，灌胃剂量根据第4 版《药理实验方法学》[9]中实验动物体表面积换算，其中西药组予阿仑膦酸钠10.51 mg/kg（1 次/周）和骨化三醇丸0.075 μg/kg（1 次/d）灌胃，滋阴通络方低、中、高剂量组分别予滋阴通络方1.34、2.68、4.02 g/kg（1 次/d）进行灌胃，假手术组与模型组予等量生理盐水灌胃，连续灌胃12 周。

1.2.2 骨密度及骨显微结构观察 治疗结束后，将大鼠股骨固定于micro-CT 专用扫描垫上，扫描股骨头至股骨中段，每次扫描的旋转角度为0.4°，总共旋转180°扫描，9 μm 为一断层，拍摄2 张图像。使用仪器自带软件行三维重建，并采用CTan 软件对选定区域骨密度（bone mineral density，BMD）和骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度、骨小梁模式因子及结构模型指数等骨小梁参数进行分析。

1.2.3 血清骨代谢指标检测 治疗结束后，禁食水，行腹主动脉采血，全血静置2 h，3000 r/min（离心半径为8 cm），离心10 min。吸取血清，严格按照PⅠNP、NTX 及CTX-Ⅰ检测试剂盒说明书操作，采用酶联免疫吸附法计算血清骨代谢指标PⅠNP、NTX、CTX-Ⅰ含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 滋阴通络方对各组大鼠BMD 的影响

模型组BMD 低于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。滋阴通络方各剂量组BMD 均高于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。滋阴通络方不同剂量组BMD 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 滋阴通络方对各组大鼠BMD 的影响（g/cm3，）

表1 滋阴通络方对各组大鼠BMD 的影响（g/cm3，）

注：与假手术组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。BMD：骨密度

2.2 滋阴通络方对各组大鼠骨微结构的影响

模型组股骨骨小梁间隙增大，排列稀疏，而西药组及滋阴通络方各治疗组均可不同程度地改善大鼠股骨骨小梁显微结构（图1～2）。模型组骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量低于假手术组，骨小梁分离度、骨小梁模式因子、结构模型指数高于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；滋阴通络方各剂量组的骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量高于模型组，骨小梁分离度、骨小梁模式因子、结构模型指数则低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；滋阴通络方不同剂量组骨小梁参数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 滋阴通络方对各组大鼠骨小梁参数的影响（）

表2 滋阴通络方对各组大鼠骨小梁参数的影响（）

注：与假手术组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05

图1 各组大鼠股骨二维结构图

图2 各组大鼠股骨三维结构图

2.3 滋阴通络方对各组大鼠骨代谢指标的影响

模型组血清CTX-Ⅰ、NTX 高于假手术组，PⅠNP水平低于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；滋阴通络方各剂量组大鼠血清CTX-Ⅰ、NTX 含量低于模型组，PⅠNP 水平高于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；滋阴通络方中不同剂量组CTX-Ⅰ、NTX及PⅠNP 水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。

表3 滋阴通络方对各组大鼠骨代谢指标的影响（）

表3 滋阴通络方对各组大鼠骨代谢指标的影响（）

注：与假手术组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。PⅠNP：Ⅰ前胶原氨基端原肽；NTX：Ⅰ型胶原氨基末端端肽；CTX-Ⅰ：Ⅰ型胶原C末端肽

3 讨论

女性绝经后雌激素水平下降，导致骨吸收大于骨形成，骨代谢失衡，造成骨量丢失，最终诱发骨质疏松[10]。去卵巢骨质疏松大鼠模型造模技术成熟，是研究PMOP的常用模型[8]。阿仑膦酸钠可有效抑制骨吸收，阿法骨化醇可促进小肠对钙的吸收，两药联用可有效改善骨代谢，提高BMD，改善骨显微结构[11]，故将其选为阳性对照组。BMD 是PMOP 诊断的金标准[12]，常用评估抗骨质疏松疗效，结果显示，模型组BMD 较假手术组降低，表明造模成功[8]，而服用滋阴通络方后，去卵巢大鼠骨密度显著增加，提示滋阴通络方可增加去卵巢大鼠BMD。但BMD 在评估骨微结构方面具有一定的局限性[13]。而骨微结构与骨折发生息息相关，是抗骨质疏松治疗效果评价中的重要组成部分[14]，micro-CT 可全面、精确、无创了解骨小梁变化[15]。当发生骨质疏松时，骨小梁间隙增加，网状结构受到破坏，增加了骨折危险性[16]。本研究结果显示模型组骨小梁间隙增加，排列稀疏，骨微结构破坏严重，而经滋阴通络方灌胃治疗后，骨小梁间隙减小，排列更为紧密，骨微结构得到改善。而滋阴通络方各剂量组骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度等骨小梁参数较模型组增加，骨小梁分离度、骨小梁模式因子、结构模型指数较模型组下降（P ＜0.05），提示不同剂量滋阴通络方可增加去卵巢骨质疏松大鼠骨小梁数量，提高骨小梁厚度，减小骨小梁分离程度，进而改善骨显微结构。

NTX 与CTX-Ⅰ是Ⅰ型胶原的降解产物，是评价骨吸收的敏感标志物，PⅠNP 可反应Ⅰ型胶原蛋白合成水平，是评价骨形成的标志物[17]，因而临床将这三种指标作为评估骨代谢的常用标志物[18]。研究结果显示，切除卵巢后，大鼠PⅠNP 下降，NTX 与CTX-Ⅰ含量上升，而服用滋阴通络方后，去卵巢大鼠血清PⅠNP水平上升，NTX 与CTX-Ⅰ含量降低，提示滋阴通络方可有效促进骨形成，抑制骨吸收，改善骨代谢。

中医认为PMOP 多以肝肾亏虚所致，因而临床常以补益肝肾法治疗PMOP[19]。滋阴通络方中熟地、女贞子共为君药，可滋补肝肾，益精填髓。桑寄生、麦冬、牛膝、白芍、当归、乌梢蛇、鸡血藤、蜈蚣滋阴补肾，填精壮骨，活血通络，共为臣药。佐以黄芪、白术、防风，增强脾胃吸收能力，以防君臣之药滋补太过。甘草为使药，调和诸药。诸药相合，共奏补益肝肾，滋阴活血通络之功。现代药理学研究证明[20]，补益肝肾中草药可通过多种途径来影响骨代谢。而滋阴通络方中含有的熟地[21]、女贞子[22]、牛膝[23]等补益肝肾类中药，可能对骨代谢起到调节作用。

PMOP 的发生是多因素、多环节、多靶点共同作用的结果[24]，而中药治疗PMOP 具有“多组分、多途径”的优势[25]。本实验结果初步显示了滋阴通络方能够通过促进骨形成、抑制骨吸收，从而提高去卵巢大鼠骨密度并改善骨组织微结构，达到防治骨质疏松症的作用。