脂肪间充质干细胞外泌体对大鼠缺血/再灌注损伤心肌的作用及Wnt3a/β-catenin 信号通路的影响

陈晓佳 郭子傲 郭金华 李林科 张剑凯 杨 春 崔晓军

广东医科大学干细胞与再生医学重点实验室，广东东莞 523808

近年来动脉粥样硬化性心血管病（arteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）发病率逐年上升，ASCVD 指动脉粥样硬化斑块堵塞血管导致缺血梗死，发病急，死亡率高[1]。得益于经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）的发展和普及，堵塞的冠状动脉可及时复通，病死率下降明显，但冠状动脉复通引起的心肌缺血/再灌注后损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）可影响PCI 的疗效和预后，如何有效保护和防治MIRI 成为临床上亟待解决的重要问题之一[2-4]。有研究显示[5]，脂肪间充质干细胞外泌体（adipose mesenchymal stem cell-exosomes，ADMSC-exs）可通过抗细胞凋亡和促进血管生成来预防MIRI[6-7]，然而其对MIRI 预防机制尚不清楚，故本研究在前期细胞实验的基础上[8]，通过建立I/R 动物模型，研究ADMSC-exs 对MIRI 的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年SD 大鼠[合格证、生产许可号：No440021000 300001、SCXK（粤）2016-0041]，饲养于广东医科大学实验动物中心，实验操作均符合伦理要求。

1.2 试剂与药品

戊巴比妥钠（德国默克公司，批号：1703163）；酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）酶联免疫吸附试验试剂盒（美国Bio Vision 公司，批号：P170550、P181120、P161008）；TUNE荧光试剂盒（塞维尔生物技术有限公司，批号：GB17002）；一抗B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（美国Abnova 公司，批号：AB18455、AB16321）；一抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific protease，caspase-3）、Wnt3a、β-catenin（美国Novus Biologicals公 司，批 号：NB10056708、NB10056708、5036 WN010、NBP154467SS）；二抗（上海碧云天生物技术有限公司，批号：J20170810）；Wnt3a/β-catenin 抑制剂XAV939（BioVision 公司，批号：P160616）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及给药 40 只成年SD 大鼠，随机原则，制作随机数字表，分为S 组[假手术组，只开胸不结扎冠状动脉左前降支（left anterior descending，LAD）]、I/R 组（结扎LAD 30 min后再灌注）、Ex 组（结扎LAD 30 min 后再灌注，再灌注5 min 内尾静脉注射ADMSC-exs）、Ex+X 组（结扎LAD 30 min 后再灌注，再灌注5 min 内从尾静脉注射ADMSC-exs 和XAV939）。每组10 只。每只鼠的给药量为200 μl 含400 μg ADMSC-exs；Ex+X 组每只鼠给药量为200 μl 含400 μg ADMSC-exs 和10 μmol/L XAV939。

1.3.2 血清心肌酶检测 再灌注4 h 后，取2 ml 全血，4500 r/min 离心10 min，离心半径16 cm，取血清，检测CK-MB、LDH 和cTnI 的水平。

1.3.3 心肌细胞凋亡评估 再灌注4 h 后，取心脏，制作冰冻切片，切片PBS 溶液清洗3 次，加入含0.1%Triton X-100 的PBS，冰上孵育2 min，切片上滴加50 μl TUNEL 检测液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗涤3 次，封片后荧光显微镜下观察。心肌细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）=平均光密度×（凋亡阳性细胞数/总心肌组织细胞数）×100%。

1.3.4 凋亡相关蛋白和Wnt3a/β-catenin 信号检测取心脏，RIPA 裂解，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后将蛋白电转移到PVDF 膜上。5%脱脂奶粉孵育，在4℃下加入一抗抗体Bcl-2（1∶2000）、Bax（1∶2000）、caspase-3（1∶4000）、Wnt3a（1∶2000）、β-catenin（1∶3000）和β-actin（1∶1000）摇床孵膜8 h。辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG 或羊抗鼠IgG 二抗孵育4 h，曝光仪显影。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌酶水平比较

I/R 组LDH、CK-MB、cTnI 水平高于S 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。Ex 组心肌酶水平低于I/R 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。当尾静脉注射Wnt3a/β-catenin 通路抑制剂XAV939 后，Ex+X 组心肌酶水平高于S 组和Ex 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与I/R 组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 各组心肌酶水平比较（）

表1 各组心肌酶水平比较（）

注：与S 组比较，aP ＜0.05；与I/R 组比较，bP ＜0.05；与Ex 组比较，cP ＜0.05。LDH：乳酸脱氢酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶；cTnI：肌钙蛋白I

2.2 各组AI 比较

I/R 组AI 高于S 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。给予ADMSCs-ex 治疗后，Ex 组AI 低于I/R 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。Ex+X 组AI 高于Ex 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 各组AI 比较（%，）

表2 各组AI 比较（%，）

注：与S 组比较，aP ＜0.05；与I/R 组比较，bP ＜0.05；与Ex 组比较，cP ＜0.05。AI：凋亡指数

2.3 各组凋亡相关蛋白和Wnt/β-catenin 信号检测比较

I/R 组Bcl2/Bax、Wnt3a、β-catenin 水平低于S组，caspase-3 水平高于S 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。Ex 组Bcl2/Bax、Wnt3a、β-catenin 水平高于I/R 组，caspase-3 水平低于S 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。Ex+X 组Bcl2/Bax、Wnt3a、β-catenin 水平低于S 组，caspase-3 水平高于Ex 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

表3 各组凋亡相关蛋白和Wnt3a/β-catenin 信号检测比较（）

表3 各组凋亡相关蛋白和Wnt3a/β-catenin 信号检测比较（）

注：与S 组比较，aP ＜0.05；与I/R 组比较，bP ＜0.05；与Ex 组比较，cP ＜0.05。Bcl2/Bax：抗B 淋巴细胞瘤-2 基因/Bcl-2 相关X 蛋白；caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

3 讨论

由ASCVD 导致的心肌梗死是临床常见的急危重症，虽然PCI 可降低死亡率，但冠状动脉I/R 后导致的二次打击MIRI 仍是影响患者康复和预后的潜在危险。再灌注后引起的心肌细胞微环境改变导致心肌死亡可影响患者心功能恢复，甚至诱发心力衰竭[9]，故在进行PCI 的前后预防和治疗MIRI 可明显提高和巩固PCI 的治疗效果[10]。

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有的多谱系分化优势，可用于组织再生修复，研究发现[11]，MSC 可为受损心肌组织提供有利于再生和修复的微环境。因为体外培养的MSC 免疫原性增强，移植后归巢率低，潜在的癌变风险等因素，限制了MSC 直接体内移植的应用，所以MSC 的旁分泌因子越来越受到重视[12]。外泌体是一种直径30～100 nm 的脂质双层细胞外囊泡，可携带遗传物质和蛋白质在细胞间传递[13]。据报道，MSCs 外泌体有保护受损心肌细胞的功能，本课题组前期细胞实验已证实了ADMSC-exs 可通过预防和保护MIRI[8]。

CK-MB、LDH 和cTnI 可用于评估和预测心肌梗死的严重程度[14-15]，实验结果显示，I/R 组血清心肌酶量升高，提示I/R 模型建立成功。Ex 组血清中心肌酶水平较I/R 组下降，提示ADMSC-exs 可保护受损的心肌细胞。

MIRI 发生时，心肌微环境改变可导致细胞凋亡[16]，MSCs 外泌体能阻止心肌梗塞后缺血心肌处的心肌细胞凋亡[17]。TUNEL 检测结果显示，I/R 组AI 较其他三组明显升高，Ex 组AI 明显低于I/R 组，提示ADMSCexs 可预防受损的心肌细胞发生凋亡。Bcl-2、Bax、caspase-3 与细胞凋亡密切相关，Bcl-2、Bax 是凋亡的“分子开关”，当Bcl-2 表达量高于Bax 时，可抑制细胞凋亡，抑制caspase-3 的表达亦可阻止细胞凋亡[18-20]。过表达的Bax 可在线粒体膜上形成同源二聚体，增加线粒体膜的通透性，导致细胞色素C 外流，触发凋亡执行者caspase-3 活性诱导细胞凋亡[21-22]。Bcl-2 可与Bax 形成异源二聚体阻止Bax 的促凋亡效应[23]。进一步检测各组Bcl-2/Bax 显示，Ex 组Bcl-2/Bax 比值明显高于I/R 组，且Ex 组caspase-3 表达量明显低于I/R 组。据此可推测，ADMSC-exs 可通过调控Bcl-2与Bax 相对表达量抑制受损的心肌凋亡，进而保护心脏。

Wnt3a/β-catenin 信号通路参与调控细胞的凋亡和增殖，Wnt3a 表达量升高，可增加细胞内β-catenin 的量，调节细胞增殖和凋亡，XAV939 是Wnt3a/β-catenin信号通路的特异性抑制剂，可阻断Wnt3a/β-catenin信号通路对下游基因的调控[24-25]。实验结果显示，给予XAV939 抑制剂的Ex+X 组中，心肌酶、AI 均明显升高，接近I/R 组水平，ADMSCs-exs 保护受损心肌的作用消失，Ex+X 组Bcl-2/Bax、caspase-3 表达量低于Ex组，抵消了ADMSCs-exs 对心肌的保护作用。

综上所述，ADMSC-exs 对大鼠I/R 损伤心肌具有保护作用，其作用机制与Wnt3a/β-catenin 信号通路有关。